PROTEÍNA INSECTICIDA SECRETADA Y COMPOSICIONES DE GENES DE BACILLUS THURINGIENSIS Y SUS USOS.

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína toxina insecticida de Bacillus thuringiensis activa frente a una plaga de insectos lepidópteros,

comprendiendo dicha proteína toxina insecticida una secuencia polipeptídica seleccionada de ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de genes que codifican proteínas tóxicas para insectos lepidópteros y fragmentos insecticidas de las mismas. En particular, la presente invención está dirigida a proteínas de ejemplo denominadas en el presente documento TIC900, TIC402, TIC403, TIC404, TIC961, TIC962, TIC963, TIC965 y TIC966, y fragmentos insecticidas de las mismas, cada una codificada por secuencias que codifican nucleótidos de ejemplo denominadas en el presente documento respectivamente tic900, tic402, tic403, tic404, tic434, tic961, tic962, tic963, tic965, y tic966, así como los homólogos de secuencia de nucleótidos que (1) codifican proteínas insecticidas y (2) hibridan con las secuencias codificadoras tic900, tic402, tic403, tic404, tic434, tic961, tic962, tic963, tic965 y tic966 bajo condiciones de hibridación rigurosas. La presente invención también se refiere a células huésped transformadas con una o más secuencias de nucleótidos de la presente invención o transformadas con variantes de las secuencias de nucleótidos expuestas en el presente documento, genes relacionados por identidad y/o similitud con las secuencias expuestas en el presente documento, y/o sus homólogos, en particular las secuencias que se han modificado para una expresión mejorada en plantas. En una forma de realización de preferencia, las células huésped transformadas son células vegetales.

Casi todos los cultivos de campo, plantas y zonas agrícolas comerciales, son susceptibles al ataque de una o más plagas de insectos. Particularmente problemáticas son las plagas de Coleópteros y Lepidópteros. Por ejemplo, cultivos vegetales y coles, tales como alcachofas, colinabo, arúgula, puerros, espárragos, lentejas, judías, lechuga (por ejemplo, cogollo, hojas, lechuga romana), remolacha, bok choy, malanga, brécol, melones (melón bordado, melón, melón de invierno, melazo, cantalupo), coles de Bruselas, col, cardo, zanahorias, nabo, coliflor, okra, cebollas, apio, perejil, garbanzos, pastinaca, achicoria, guisantes, col china, pimientos, col común, patatas, calabacín, calabaza pupkin, cucurbitáceas, rábanos, bulbos secos de cebolla, rutabaga, berenjena, salsifí, escarola, chalota, endivias, soja, ajo, espinacas, cebolla verde, calabaza, emilaz, remolacha azucarera, batatas, nabo, acelgas, rábano picante, tomates, col crespa, nabo y una diversidad de especias son sensibles a la infestación por una o más de las siguientes plagas de insectos: gusano medidor de la alfalfa, orugas militares, escarabajo soldado, polilla de los penachos de la alcachofa, gusano perforador de la col, falso medidor de la col, gusano de la telaraña de la col, gusano del fruto del maíz, comedor de hojas de apio, gusano veteado de la col, barrenador europeo del maíz, palomilla dorso de diamante, gusano verde del trébol, gusano importado de la col, gusano del melón, rosquilla omnívora, barrenador del fruto de las cucurbitáceas, gusano de la cáscara de las cucurbitáceas, gusano peludo, oruga desfoliadora de la soja, gusano del tabaco, gusano del fruto del tomate, gusano del cuerno del tomate, gusano alfiler, oruga de las leguminosas y gusano soldado veteado. Igualmente, los pastos y cultivos de forraje tales como alfalfa, hierbas de pasto y forraje ensilado se ven atacados a menudo por plagas de insectos tales como la oruga militar, gusano soldado de la vaca, mariposita amarilla de la alfalfa, adopaea, diferentes gusanos medidores y mosquitas de telaraña así como por gusano soldado veteado.

Los cultivos frutículas y vinícolas tales como manzanas, albaricoques, cerezas, nectarinas, albaricoques, peras, ciruelas, prunas, membrillos, castaña, avellanas napolitanas, nuez pecana, pistachos, nueces, cítricos, zarzamora, arándanos, frambuesa, arándano rojo, grosellas, moras, frambuesa, fresas, uvas, aguacates, bananas, kiwi, caquis, granada, piña y frutas tropicales son a menudo susceptibles de ataque y defoliación debido a gusano del cuerno, amorbia, gusano soldado, gusano cortador de los cítricos, mosca del banano, gusano ropobota, Sparganothis sulfureana, oruga agrimensora americana, gusano del fruto de la cereza, gusano cortador de cítricos, horadador del arándano americano, gusano telarañoso oriental, gusano de bolsa, oruga cigarrera, cidya latiferreanus, gusano arrollador de la hoja del frutal, endopiza, gusano arrollador de la uva, esqueletizador de la hoja de parra, gusano del fruto verde, gummosos-batrachedra commosae, lagarta peluda, gusano barrenador de la nuez, gusanos del cuerno, gusanos grises, gusano de la naranja navelina, arrollador de las hojas de bandas oblicuas, rosquilla omnívora, gusano medidor omnívoro, gusano arrollador de bandas, larva de la mariposa cola de golondrina gigante, gusano oriental del ciruelo, arrollador de hojas pandemis, gusano perforador del ciruelo, barrenador de la nuez pecana, gusano arrollador de bandas rojas, gusano tórix, gusano cortador de la fresa, gusano peludo, desfoliador del olmo, oruga de la tienda, polilla tecla, oruga del tabaco, tórtrix de la naranja, gusano arrollador del manzano, gusano arrollador variegato, oruga de la nuez, oruga de la tienda occidental y gusano soldado veteado.

Los cultivos campestres tales como semillas de canola / colza, onagra, berenjena

escalfada de Douglas, maíz (de campo, dulce, para palomitas), algodón, lúpulo, jojoba, cacahuetes, cártamo, granos pequeños (cebada, salvado, centeno, trigo), sorgo, soja, girasoles y tabaco son a menudo dianas para la infestación por plagas de insectos entre los que se incluyen orugas militares, perforadores asiáticos y otros perforadores del maíz, polilla de bandas de girasol, gusano soldado de la remolacha, falso medidor, gusano de la raíz del maíz (que incluye las variedades meridionales y occidentales), perforador de las hojas de algodón, palomilla dorso de diamante, perforador europeo del maíz, gusano verde del trébol, polilla del girasol, gusano del girasol, gusano importado de la col, orugas (incluida Anacamptodes spp.), arrollador de hojas de bandas oblicuas, gusano arrollador omnívoro, gusano del grano, gusano peludo, horadador del maíz suroccidental, oruga de la soja, xestia, polilla del girasol, oruga del tabaco, gusano del cuerno del tabaco y oruga de las leguminosas.

Las plantas de invernadero, flores, plantas ornamentales y sus contenedores son con frecuencia alimentados con un huésped de plagas de insectos tales como gusano soldado, polilla de la azalea, gusano soldado de la remolacha, palomilla dorso de diamante, gusano cachón (gusano del cuerno), oruga de florida, polilla Ío, gusanos grises, polilla de oleander, arrollador omnívoro y oruga del tabaco.

Los árboles del bosque, frutales, ornamentales y productores de nueces, así como otros arbustos y plantas de vivero son a menudo susceptibles de ataque por diferentes insectos tales como gusano tejedor, Acleris gloverana, polilla de cola marrón, Phryganidia californica, polilla de los montecillos de abetos de Douglas, spanworm del olmo, gusano telarañero tardío, arrollador del frutal, Dryocampa rubicunda, lagarta peluda, gusano del pino banksiano, gusano telarañero de la mimosa, mariposa del pino, gusano tórax, oruga de silla de montar, oruga de silla prominente, desfoliador de primavera y otoño, gusano de las yemas del abeto, oruga de la tienda, gusano tórtrix, y Orgyia vetusta. Igualmente, las hierbas de césped son atacadas a menudo por plagas de insectos tales como orugas militares, gusano peludo del césped y gusano peludo del césped tropical.

Debido a que los cultivos de interés comercial son a menudo la diana del ataque de los insectos, son deseables en muchos casos procedimientos ambientalmente sensibles para combatir o erradicar la infestación de insectos. Esto es particularmente cierto para granjeros, horticultores, cultivadores y en zonas comerciales y residenciales, en las que se pretende combatir las poblaciones de insectos usando composiciones respetuosas con el medioambiente.

Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva que produce inclusiones cristalinas proteicas durante la esporulación. Estas proteínas cristalinas de B. thuringiensis son a menudo altamente tóxicas para insectos específicos. Se han identificado actividades insecticidas para las proteínas cristalinas de diversas cepas de B. thuringiensis contra larvas de insectos de los órdenes Lepidoptera (orugas), Coleoptera (escarabajos) y Diptera (mosquitos, moscas).

Las proteínas cristalinas individuales de B. thuringiensis, también llamadas delta endotoxinas o proteínas cristalinas parasporales o proteína tóxica, pueden diferir mucho en sus estructuras...

1. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína toxina insecticida de Bacillus thuringiensis activa frente a una plaga de insectos lepidópteros, comprendiendo dicha proteína toxina insecticida una secuencia polipeptídica seleccionada de ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde

(i) dicha plaga de insectos lepidópteros se selecciona de las familias Noctuidae, Tortricidae, Epinotia aporema, Anticarsia gemmatalis, Psedoplusia includens, el barrenador europeo del maíz (ECB), la oruga del tabaco (TBW), el gusano cortador negro (BCW) y la palomilla dorso de diamante (DBM); o

(ii) dicha toxina tiene un peso molecular entre 65 kDa y 70 kDa, y seleccionándose dicha toxina insecticida de ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966).

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos se ha optimizado para la expresión en plantas, de preferencia dicha secuencia de nucleótidos se ha optimizado para

(a) expresión en una planta monocotiledónea, comprendiendo dicha optimización una

o más de las etapas seleccionadas de

(i) eliminar las secuencias de poliadenilación,

(ii) ajustar el contenido de A y T de la secuencia de nucleótidos para que sea del

40% al 49% sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína, y

(iii) modificar los codones en la secuencia codificadora para que resulten coherentes con las etapas (a)(i) y (a)(ii); o

(b) expresión en una planta diocotiledónea, comprendiendo dicha optimización una o más de las etapas seleccionadas de

(i) eliminar las secuencias de poliadenilación,

(ii) ajustar el contenido de A y T de la secuencia de nucleótidos para que sea del 40% al 49% sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína, y

(iii) modificar los codones en la secuencia codificadora para que resulten coherentes con las etapas (b)(i) y (b)(ii).

4. Una proteína insecticida aislada de Bacillus thuringiensis que comprende una secuencia polipeptídica seleccionada de ID. SEC. Nº 4 (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly.

5. La proteína aislada como en la reivindicación 4, en la que

(i) dicha porción insecticida se selecciona de ID. SEC. Nº 4 (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o

(ii) dicho Bacillus thuringiensis es EG5438 depositado en el NRRL bajo el número de referencia NRRL B-30584.

6. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Una célula huésped transformada para contener un polinucleótido según se define en

una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. La célula huésped de la reivindicación 7, siendo dicha célula huésped una célula vegetal y dicho polinucleótido se ha optimizado según se define en la reivindicación 3.

9. Un procedimiento para combatir una plaga de insectos lepidópteros que comprende poner en contacto dicha plaga con una cantidad plaguicida de una toxina de Bacillus thuringiensis de 70 kDa de la reivindicación 1 o 2.

10. La célula huésped de la reivindicación 8 que comprende una célula de planta monocotiledónea seleccionada de una célula de planta de maíz, una célula de planta de trigo, una célula de planta de arroz, una célula de planta de avena, una célula de planta de cebolla y una célula de planta de hierba.

11. La célula huésped de la reivindicación 8 que comprende una célula de planta dicotiledónea seleccionada de una célula de planta de algodón, una célula de planta de canola, una célula de planta de soja, un célula de planta de tabaco, una célula de planta de árboles frutales, una célula de planta crucífera, una célula de planta de pimiento o pimentero, una célula de planta ornamental, una célula de planta de girasol, una célula de planta cucurbitácea y una célula de planta de melón.

12. Un procedimiento para expresar en una planta una proteína insecticida tóxica para los insectos lepidópteros, que comprende las etapas de:

(a) insertar en el genoma de una célula vegetal una secuencia de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' una molécula de ADN de doble hebra, recombinante y unida de manera operativa, en la que la molécula de ADN de doble hebra, recombinante comprende:

(i) un promotor que funciona en la célula vegetal

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos insecticida según se presenta en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(iii) una secuencia de nucleótidos 3' no traducida que funciona en las células de la planta provocando la terminación de la transcripción;

(b) obtener una célula vegetal transformada que contiene la secuencia de ácido nucleico de la etapa (a); y

c) generar a partir de dicha célula vegetal transformada una planta que expresa la 5 proteína insecticida en la planta transformada.

13. Una semilla de la planta que puede obtenerse por el procedimiento de la reivindicación12 o una progenie de dicha semilla, comprendiendo dicha semilla y dicha progenie la secuencia de ácido nucleico según se define en una cualquiera de las

10 reivindicaciones 1 a 3.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que dicha célula vegetal es

(a) una célula de planta monocotiledónea que comprende una célula de planta de

15 maíz, una célula de planta de trigo, una célula de planta de arroz, una célula de planta de avena, una célula de planta de cebolla y una célula de planta de hierba, o

(b) una célula de planta dicotiledónea que comprende una célula de planta de algodón, una célula de planta de canola, una célula de planta de soja, un célula de

20 planta de tabaco, una célula de planta de árboles frutales, una célula de planta crucífera, una célula de planta de pimiento o pimentero, una célula de planta ornamental, una célula de planta de girasol, una célula de planta cucurbitácea y una célula de planta de melón.

25 15. Una muestra biológica derivada de los tejidos o semilla de la planta que puede obtenerse por el procedimiento de la reivindicación 12, comprendiendo la muestra una cantidad detectable de la secuencia de nucleótidos según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

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