PROTEINA CRIOPROTECTORA CON ACTIVIDAD 1-3 B - GLUCANASA A BAJAS TEMPERATURAS, PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCION Y SUS APLICACIONES.

Proteína crioprotectora con actividad 1-3 {be}-glucanasa a bajas temperaturas,

procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.La presente invención describe una nueva proteína 1-3 {be}-glucanasa biológicamente activa a bajas temperaturas, en un rango de pH ácido-neutro, estable a pH ácidos y altamente crioprotectora. Además, se incluye el método para la producción, el aislamiento y purificación de dicha proteína y su uso en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y en procesos de degradación o modificación de materiales que contienen {be}-glucanos en condiciones que requieran bajas temperaturas. Esta proteína glucanasa puede utilizarse en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación para su almacenamiento y distribución en forma congelada o liofilizada, así como para la degradación o modificación de materiales que contienen glucanos en condiciones que requieran bajas temperaturas o inactivación a moderada-alta temperatura

Proteína crioprotectora con actividad 1,3-β-glucanasa a bajas temperaturas, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el sector Biotecnológico, más concretamente en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y su aplicación en la industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica (crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica (proteínas con actividad biológica), así como en biocatálisis, bioremediación, biocontrol, fermentación y conservación de alimentos.

Estado de la técnica

Las 1,3-β-glucanasas incluyen el grupo de proteínas glucano 1,3-β-D-glucosidasas también llamadas laminarinasas. Estas proteínas catalizan la ruptura hidrolítica de enlaces 1,3-β-D-glucosídicos entre residuos de D-glucosa de los homopolímeros 1,3-β-glucanos. Las 1,3-β-glucanasas son proteínas abundantes y altamente reguladas presentes en especies de plantas con semillas e implicadas en diferentes procesos metabólicos como estrés, infección y procesos de desarrollo. Existen múltiples isoenzimas estructurales que difieren en su tamaño, punto isoeléctrico, estructura primaria, localización celular y patrón de regulación. Las 1,3-β-glucanasas de clase I son básicas y están localizadas en la vacuola. Las clases II y III son ácidas, con ausencia de la extensión C-terminal presente en la clase I y son secretadas al espacio intracelular (Leubner-Metzger G, Meins F. 1999. Functions and regulation of plant β-1,3-glucanases (PR-2),In: Pathogenesis-related Proteins in Plants. Datta,S.K., Muthukrishnan, S. (Eds.). Boca-Raton, Florida, CRC Press, pp. 49-76.).

Las glucanasas con conocida actividad antifúngica son mayoritariamente endo-1,3-glucanasas de clase I capaces de hidrolizar enlaces β-1,3-glicosídicos. Estas proteínas muestran, además, un significativo efecto sinérgico junto a endoquitinasas o exoglucanasas sobre la degradación de la pared celular de hongos.

Los β-glucanos son la clase más abundante de polisacáridos, siendo componentes estructurales esenciales de la pared celular de plantas, principalmente en el endospermo de cereales, de la de hongos y bacterias, así como material de reserva citoplásmico, vacuolar y extracelular.

Un hecho importante referente al uso de β-glucanasas en productos alimenticios es que la mayor parte del material derivado de plantas contiene diferentes tipos de β-glucanos. Éstos pueden ser importantes en el mantenimiento de las propiedades organolépticas tales como textura, viscosidad y apariencia de los alimentos conteniendo paredes celulares vegetales.

Las proteínas 1,3-β-glucanasas son aplicadas en procesos de biorremediación para degradar o modificar materiales conteniendo 1,3-β-glucanos. Así mismo, las glucanasas junto con proteasas, quitinasas y celulasas son frecuentemente consideradas críticas en el biocontrol de hongos fitopatógenos (Fuglsang CC, Johansen C, Christgau S, Adler-Nissen J. 1995. Antimicrobial enzymes: applications and future potential in the food industry. Trends in Food Science & Technology, December, 6, 390-396). Las glucanasas ocupan una posición única en la agricultura biotecnológica por su acción antifúngica ya que su actividad lítica inhibe el desarrollo de hongos puesto que degrada componentes clave de la pared celular. Por todo lo anterior las glucanasas juegan una función vital en la industria relacionada con la agricultura, en el campo médico y en la composición de los detergentes. Asimismo, son fundamentales en la industria alimentaria para mejorar la textura y digestibilidad de los alimentos frescos y procesados, ejerciendo su efecto sobre hongos y bacterias que contaminan y deterioran alimentos conservados a bajas temperaturas y en la producción de alimentos fermentados, como cerveza y vino, así como en la elaboración de piensos de animales. En la industria de alimentos fermentados el uso de tales proteínas p.e. disminuye la viscosidad causada por los compuestos β-glucanos incrementando la obtención de extracto, acelerando la clarificación natural y disminuyendo el número de filtraciones, evitando precipitados gelatinosos en el producto final. Para su aplicación en estos procesos se requieren 1,3-β-glucanasas termoestables, pero también es necesario que retengan un alto porcentaje de su actividad en un rango de pH de 4 a 5, y que sean estables durante la incubación a estos pH ácidos característicos de la etapa de trituración. Por tanto se requieren proteínas biológicamente activas adecuadas para su uso en los procedimientos industriales, ampliando así su gama de aplicación.

Por tanto, la actividad y estabilidad de estas enzimas en diferentes condiciones de pH y temperatura son parámetros esenciales que determinan su viabilidad económica en procesos industriales. Así, una alta estabilidad está generalmente considerada como una ventaja económica porque reduce la cantidad de enzima mínima catalíticamente útil (turnover).

Con el fin de aumentar la estabilidad de las enzimas se han empleado múltiples y diferentes estrategias tales como: mutaciones, modificación química del centro activo, introducción de puentes disulfuro, inmovilizaciones, estabilización entrópica, cambio de condiciones del pH y el uso de diferentes sales. Por otro lado, el conocer los datos termodinámicos de las enzimas y su reacción de catálisis es esencial para predecir el ámbito de la reacción y la posición de cualquier proceso en el cual la reacción se produce. Por lo que para conocer la estabilidad un paso previo es determinar su actividad residual y el valor de energía libre de estabilización a una temperatura definida, a fin de asegurar la viabilidad económica y técnica para su uso en procesos industriales.

Recientemente se están estudiando un nuevo grupo de enzimas llamadas "enzimas adaptadas al frío" (cold-adapted enzymes), las cuales muestran una alta eficiencia catalítica a bajas temperaturas, presentan un valor bajo de energía de activación (E_a) y se encuentran en general, si no siempre, asociadas a una alta termosensibilidad, lo que permiten el control de la reacción enzimática a través de su inactivación por calor. Esta propiedad ofrece la ventaja adicional de poder ser inactivadas fácilmente durante el proceso, a relativa moderada temperatura, y de esa manera ejercer un control sobre el mismo. Estas enzimas ofrecen un considerable potencial para su aplicación en diferentes procesos industriales relacionados con la formulación de detergentes, en industrias alimentarias, en la síntesis de productos químicos de alta pureza y en biorremediación (Gerday C, Aittaleb M, Bentahir M, Chessa J, Claverie P, Collins T, D'Amico S, Dumont J, Garsoux G, Georlette D, Hoyoux A, Lonhienne T, Meuwis M, Feller G. 2000. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology. Trends in Biotechnology,18, 103-107).

A pesar de su potencial aplicación biotecnológica, pocas enzimas activas a baja temperatura están siendo utilizadas comercialmente, entre ellas una lipasa, una lisozima, una celulasa y varias proteasas (Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrews D, Sowers KR. 2002. Low-temperature extremophiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 13, 253-261.). En relación a las patentes sobre estas enzimas hay tres documentos sobre proteasas: una proteasa alcalina para su uso como detergente procedente de un actinomiceto (WO 9,743,406; 1996), dos proteasas procedentes de bacterias CP-58 (WO 9,730,172; 1997) y CP-70 (U.S. 6,200,793; 1998), y una β-galactosidasa activa por debajo de 8ºC procedente de una bacteria Antártica (Patente U.S. 6,727,084; 2001). Este tipo de proteínas son producidas, hasta ahora, por microorganismos adaptados al frío u organismos psicrofílicos, capaces de vivir a temperaturas por debajo de los 5ºC, encontrándose su temperatura óptima de desarrollo entre 4ºC y 15ºC y las estrategias utilizadas hasta ahora para al obtención de este tipo de enzimas han sido el clonaje y la expresión en E. coli creciendo a baja temperatura de genes que codifican enzimas adaptadas al frío procedente de bacterias Antárticas.

Además de sus enzimas, la utilización de microorganismos psicrófilos en los alimentos podría reemplazar a los conservantes químicos al disminuir o eliminar aquellos metabolitos requeridos por otros microorganismos. Al no ser aceptable la presencia de éstos en los alimentos, una alternativa...

1. Proteína 1-3-β-glucanasa caracterizada porque presenta actividad crioprotectora aislada de la pulpa de chirimoya (Annona cherimola Mill), constituida por una proteína monomérica con una masa molecular de 19.200 Da, y un punto isoeléctrico (pI) mayor o igual a 5,25, siendo una glicoproteína endo-1,3-β-glucanasa con una constante catalítica (k_cat) mayor de 2, preferentemente mayor de 3,1 s^-1, una constante de afinidad (K_m) mayor de 70 preferentemente de 80 μM y una eficiencia catalítica (k_cat/K_m) mayor de 35 preferentemente mayor 38,3 s^-1 mM^-1, catalíticamente activa en un rango de pH ácido-neutro de 3,0 a 7,0, estable en un rango de pH ácido, de 2,0 a 6,0, termosensible a temperaturas superiores a 50ºC y con una energía de activación (E_a) de 7,0 kJ•mol^-1, además de ser hidrolíticamente activa a bajas temperaturas, presentando un valor C₅₀ de actividad crioprotectora de 8,7 μg•ml^-1.

2. Procedimiento de obtención de la proteína 1-3-β-glucanasa según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) pretratamiento gaseoso del material vegetal de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales, subtropicales y/o subproductos agrícolas, como por ejemplo sin que ello suponga un límite del alcance de la invención la pulpa de chirimoyas (Annona cherimola Mill.), es conservado en una atmósfera enriquecida con 10% a 30% de CO₂, entre 60 y 75 horas a bajas temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido a condiciones atmosféricas durante un periodo de 3 a 10 días,

b) extracción y ultrafiltración de las proteínas del material vegetal, se tritura y homogeneiza en un medio acuoso constituido por una disolución acuosa salina, opcionalmente tamponada en un pH comprendido entre 3,0 y 10,0, preferentemente a pH 5,0, y a una temperatura entre 4 y 30ºC, preferentemente a una temperatura de 4ºC, y opcionalmente adicionando antioxidantes, agentes quelantes de cationes y secuestradores de fenoles al medio acuoso.

c) etapa de separación de la proteína de la invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:

- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad 1-3-β-glucanasa,

- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,

- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,

y opcionalmente

d) purificación mediante cualquier técnica convencional de purificación de proteínas.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque la extracción de b) se realiza mediante la adición de antioxidantes y/o agentes quelantes de cationes.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el antioxidante al siguiente grupo: ácido ascórbico, y/o secuestradores de fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidona soluble.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el agente quelante de cationes es, por ejemplo, ácido etilendiamino-tetraacético sal disódica 2-hidrato (EDTA).

6. Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque la purificación de d) se realiza mediante técnicas cromatográficas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque las técnicas cromatográficas son cromatografía de intercambio aniónico y/o cromatoenfoque.

8. Procedimiento según la reivindicación 7 caracterizado porque la cromatografía de intercambio aniónico se realiza a un pH entre 7,0 y 9,0, preferentemente a pH 8.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 caracterizado porque se realizan dos cromatoenfoques consecutivos a un pH entre 6,0 a 4,0.

10. Uso de la proteína según la reivindicación 1 en procedimientos de biocatálisis, bioremediación o como agentes biocontrol y conservación de alimentos que requieran actividad 1-3-β-glucanasa.

11. Empleo de la proteína según la reivindicación 1 en la producción de alimentos fermentados y en la industria alimentaria para mejorar la textura y digestibilidad de los alimentos.

12. Uso de la proteína según la reivindicación 1 en la industria alimentaria, médica y farmacéutica como conservante o aditivo alimentario o en la protección de proteínas, células, tejidos u órganos a bajas temperaturas, refrigerados, congelados o liofilizados.

13. Uso de la proteína según la reivindicación 1 en la elaboración de una composición biotecnológica o farmacéutica útil para la criopreservación de principios activos.

14. Uso de la proteína según las reivindicaciones 10 a 12 en forma soluble y/o inmovilizada.