Proteína crioprotectora con actividad quitinasa a bajas temperaturas,

procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.La presente invención describe una nueva proteína quitinasa biológicamente activa a bajas temperaturas, estable en un amplio rango de pH y altamente crioprotectora. Además, se incluye el método para la producción, el aislamiento y purificación de dicha proteína y su uso en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y en procesos de degradación o modificación de materiales que contienen quitina en condiciones que requieran bajas temperaturas. Esta proteína quitinasa puede utilizarse en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación para su almacenamiento y distribución en forma congelada o liofilizada, así como para la degradación o modificación de materiales que contienen quitina en condiciones que requieran bajas temperaturas o inactivación a moderada-alta temperatura

Proteína crioprotectora con actividad quitinasa a bajas temperaturas, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el sector Biotecnológico, más concretamente en la crioprotección de proteínas sensibles a la congelación-descongelación y su aplicación en la industria alimentaria (proteínas estructurales o solubles), médica (crioconservación de células y tejidos vivos) y farmacéutica (proteínas con actividad biológica), así como en biocatálisis, biorremediación, biocontrol y conservación de alimentos.

Estado de la técnica

Las proteínas quitinasas hidrolizan quitina, un polisacárido lineal que consiste en unidades de N-acetil-D-glucosamina (GIcNAc) unidas por enlaces β (I-4) glucosídicos. Cuando la quitina está desacetilada recibe el nombre de quitosan.

La quitina es el polímero más abundante que contiene nitrógeno y el segundo biopolímero más abundante de la tierra, siendo una fuente vital de nitrógeno esencial para el crecimiento y supervivencia de ecosistemas marinos y terrestres. Es un polímero natural constituyente principal de la pared celular de los hongos, del exoesqueleto de insectos y otros artrópodos, y en algunos otros animales. Por tanto las quitinasas, son esenciales para los organismos que contienen en sus estructuras quitina (hongos, insectos, crustáceos, etc.) y así mismo son utilizadas por muchas bacterias que utilizan la quitina como una fuente de carbono y de energía (Neuhaus J. 1999. Plant chitinases (PR-3, PR-4, PR-8, PR-11),In: Pathogenesis-related Proteins in Plants. Datta,S.K., Muthukrishnan, S. (Eds.). Boca-Raton, Florida, CRC Press, pp. 77-105).

Existen múltiples formas de quitinasas en la naturaleza producidas con el fin de degradar el polímero de quitina para su completa degradación en N-acetil-D-glucosamina. En el caso de las bacterias, éstas cuando se encuentran en presencia de quitina producen y secretan enzimas quitinolíticas que digieren la quitina reduciéndola en azúcares simples y amonio. Las bacterias contienen receptores específicos para los azúcares simples procedentes de la degradación de la quitina, de tal manera que éstas proliferan en aquellos lugares donde hay quitina, por lo que al descender su concentración o los organismos que la producen disminuyen por tanto su carga bacteriana.

Las plantas a su vez producen enzimas quitinolíticas como proteínas de defensa frente a patógenos, especialmente frente a hongos. Las enzimas quitinolíticas con conocida actividad antifúngica son mayoritariamente endoquitinasas (Kasprzewska, A. 2003. Plant chitinases. Regulation and function. Cellular and Molecular Biology Letters, 8, 809-824).

Además de su interés académico y fisiológico, las quitinasas son ampliamente utilizadas en procesos de biorremediación y son frecuentemente consideradas críticas, junto con proteasas, glucanasas y celulasas, en el biocontrol de hongos fitopatógenos (Deshpande MV. 1986. Enzymatic degradation of chitin & its biological applications. Journal of Scientific and Industrial Research, 45, 273-281., 1986; Fuglsang CC, Johansen C, Christgau S, Adler-Nissen J. 1995. Antimicrobial enzymes: applications and future potential in the food industry. Trends in Food Science & Technology, December, 6, 390-396. et al., 1995). Las quitinasas ocupan una posición única en la agricultura biotecnológica por su acción antifúngica ya que su actividad lítica inhibe el desarrollo de hongos al degradar componentes clave de la pared celular.

Por todo lo anteriormente expuesto las quitinasas juegan una función vital en la industria relacionada con la agricultura y en el campo médico, además, también son fundamentales en la industria de alimentos marinos para la degradación de desechos quitinosos de crustáceos o ejerciendo su efecto sobre hongos y bacterias que contaminan y deterioran alimentos conservados a bajas temperaturas.

Por tanto, la actividad y estabilidad de estas enzimas en diferentes condiciones de pH y temperatura son parámetros esenciales que determinan su viabilidad económica en procesos industriales. Así, una alta estabilidad está generalmente considerada como una ventaja económica porque reduce la cantidad de enzima mínima catalíticamente útil (turnover). Con el fin de aumentar la estabilidad de las quitinasas se han empleado múltiples y diferentes estrategias tales como: mutaciones, modificación química del centro activo, introducción de puentes disulfuro, inmovilizaciones de las enzimas, estabilización entrópica, cambio de condiciones del pH y el uso de diferentes sales. Conocer los datos termodinámicos de las enzimas y su reacción de catálisis es esencial para predecir el ámbito de la reacción y la posición de cualquier proceso en el cual la reacción se produce.

Para conocer la estabilidad de una enzima es esencial previamente determinar su actividad residual y el valor de energía libre de estabilización a una temperatura definida, a fin de asegurar la viabilidad económica y técnica para su uso en procesos industriales. Recientemente se están estudiando un nuevo grupo de enzimas llamadas "enzimas adaptadas al frío" (cold-adapted enzymes) las cuales son muy interesantes para la industria porque muestran una alta eficiencia catalítica a bajas temperaturas presentando además un valor bajo de energía de activación (E_a). Otra peculiaridad que tienen es que se encuentran en general, si no siempre, asociadas a una alta termosensibilidad, lo que permite el control de la reacción enzimática a través de su inactivación por calor fácilmente, a relativa moderada temperatura. Así mismo, este nuevo grupo de enzimas ofrecen un considerable espectro de aplicación en diferentes procesos industriales, como por ejemplo, en la elaboración de detergentes, en la industria alimentaria, en la síntesis de productos químicos de alta pureza y en biorremediación (Gerday C, Aittaleb M, Bentahir M, Chessa J, Claverie P, Collins T, D'Amico S, Dumont J, Garsoux G, Georlette D, Hoyoux A, Lonhienne T, Meuwis M, Feller G. 2000. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology. Trends in Biotechnology, 18, 103-107 et al., 2000).

A pesar de su potencial aplicación biotecnológica, muy pocas enzimas activas a baja temperatura están siendo utilizadas comercialmente, tan sólo una lipasa, una lisozima, una celulasa, varias proteasas, entre otras (Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrews D, Sowers KR. 2002. Low-temperature extremophiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 13, 253-261).

En relación a las solicitudes de patentes sobre estas enzimas hay tres documentos sobre proteasas adaptadas a bajas temperaturas: una proteasa alcalina para su uso como detergente procedente de un actinomiceto (WO 9,743,406; 1996) y dos proteasas procedentes de bacterias CP-58 (WO 9,730,172; 1997) y CP-70 (U.S. 6,200,793; 1998), y una β-galactosidasa activa por debajo de 8ºC procedente de una bacteria Antártica (Patente U.S. 6,727,084; 2001). Este tipo de proteínas son producidas, hasta ahora, por microorganismos adaptados al frío u organismos psicrofílicos, capaces de vivir a temperaturas por debajo de los 5ºC, encontrándose su temperatura óptima de desarrollo entre 4ºC y 15ºC y las estrategias utilizadas hasta ahora para la obtención de este tipo de enzimas han sido el clonaje y la expresión en E. coli, creciendo a baja temperatura, de genes que codifican enzimas adaptadas al frío procedente de bacterias Antárticas.

La utilización de microorganismos psicrófilos en los alimentos podría reemplazar a los conservantes químicos al disminuir o eliminar aquellos metabolitos requeridos por otros microorganismos no deseables. La presencia de los microorganismos en alimentos no es aceptable, por lo que una alternativa a este problema sería la adición de enzimas activas a baja temperatura de origen natural y debido al gran interés industrial que despierta este tipo de proteínas con alta actividad a bajas temperaturas, ha dado lugar a la búsqueda de nuevas fuentes naturales de proteínas más resistentes a la inactivación por bajas temperaturas.

Sin embargo, estas enzimas adaptadas al frío son un caso excepcional dentro de las proteínas, ya que en general todas las clases de proteínas, y especialmente las enzimas, pierden su actividad biológica fuera de un relativamente estrecho rango de temperatura.

Las enzimas son polipéptidos producidos por las células...

1. Proteína quitinasa caracterizada porque presenta actividad crioprotectora, aislada de la pulpa de chirimoya (Annona cherimola Mill), constituida por una proteína monomérica con una masa molecular de 14.500 Da, y un punto isoeléctrico (p/) mayor o igual a 8,26, es una endoquitinasa con una constante catalítica (k_cat) mayor de 5, preferentemente mayor de 6,8 s^-1 y una eficiencia catalítica mayor de 35 preferentemente mayor 38,7 s^-1 mM^-1, catalíticamente activa en un rango de pH de 4 a 9, estable en un rango de pH de 2,0 a 11,0, termosensible a temperaturas superiores a 45ºC y con una energía de activación (E_a) de 11,32 kJ•mol^-1, además de ser quitinolíticamente activa a bajas temperaturas, presentando un valor C₅₀ de actividad crioprotectora de 6,4 μg•ml^-1.

2. Procedimiento de obtención de la proteína quitinasa según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) pretratamiento gaseoso del material vegetal de partida, preferentemente tejidos de frutos tropicales, subtropicales y/o subproductos agrícolas, como por ejemplo sin que ello suponga un límite del alcance de la invención la pulpa de chirimoyas (Annona cherimola Mill.), es conservado en una atmósfera enriquecida con 10% a 30% de CO₂, entre 60 y 75 horas a bajas temperaturas, unos 5 a 7ºC, siendo posteriormente mantenido a condiciones atmosféricas durante un periodo de 6 a 10 días,

b) extracción y ultrafiltración de las proteínas del material vegetal, se tritura y homogeneiza en un medio acuoso constituido por una disolución acuosa salina, opcionalmente tamponada en un pH comprendido entre 3,0 y 10,0, preferentemente a pH 5,0, y a una temperatura entre 4 y 30ºC, preferentemente a una temperatura de 4ºC, y opcionalmente adicionando antioxidantes, agentes quelantes de cationes y secuestradores de fenoles,

c) etapa de separación de la proteína de la invención del resto de proteínas de la fracción soluble mediante el fraccionamiento con sulfato amónico por saturación progresiva:

- El fraccionamiento comienza con una primera precipitación de proteínas a baja concentración de sulfato amónico entre 10% y 30%, preferentemente con 20%, obteniéndose un sobrenadante enriquecido en actividad quitinolítica,

- saturándose progresivamente con sulfato amónico hasta llegar a una concentración del 80% y 90%, preferentemente del 85%,

- lavado y ultrafiltrado del precipitado, por ejemplo, por una membrana de 10.000 MW,

y opcionalmente

d) purificación mediante cualquier técnica convencional de purificación de proteínas.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque la extracción de b) se realiza mediante la adición de antioxidantes y/o agentes quelantes de cationes.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el antioxidante pertenece al siguiente grupo: ácido ascórbico, y/o secuestradores de fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidona soluble.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el agente quelante de cationes es, por ejemplo ácido etilendiamino-tetraacético sal disódica 2-hidrato (EDTA).

6. Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque la purificación de d) se realiza mediante técnicas cromatográficas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque las técnicas cromatográficas son cromatografía de intercambio aniónico y/o cromatoenfoque.

8. Procedimiento según la reivindicación 7 caracterizado porque el cromatoenfoque se realiza a un gradiente de pH de 9,0 a 7,0.

9. Uso de la proteína según la reivindicación 1 en procedimientos de biocatálisis, bioremediación o como agentes biocontrol y conservación de alimentos que requieran actividad quitinasa.

10. Uso de la proteína según la reivindicación 1 en la industria alimentaria, médica y farmacéutica como conservante o aditivo alimentario o en la protección de proteínas, células, tejidos u órganos a bajas temperaturas, refrigerados, congelados o liofilizados.

11. Uso de la proteína según la reivindicación 1 en la elaboración de una composición biotecnológica o farmacéutica útil para la criopreservación de principios activos.

12. Uso de la proteína según las reivindicaciones 9 a 11 en forma soluble y/o inmovilizada.

13. Uso de la proteína según las reivindicaciones 9 a 11, sola o acompañada con otros crioprotectores.