Una cepa de Saccharomyces cerevisiae productora de etanol CEN.

PK 113-5D, que es capaz de crecer y producir etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos, que comprende compuestos inhibidores del crecimiento del grupo furfural y 5-hidroxi-metil-furfural, en una fermentación discontinua, de alimentación discontinua o continua, cepa que está sobre-regulada y/o sobreexpresada con respecto al gen ADH6, en que la alcohol deshidrogenasa es dependiente de NADPH

Productividades de etanol de cepas de Saccharomyces cerevisiae en fermentación de hidrolizados en ácidos diluidos dependientes de sus capacidades de reducción de furano.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una cepa de Saccharomices cerevisiae que es capaz de crecer y producir etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos en presencia de compuestos y sustancias inhibidores, en particular furfural y sus derivados, mientras reduce estos compuestos y, en particular, se refiere a una cepa que es capaz de producir etanol en un sistema de producción de alimentación discontinua o continua. La invención se refiere adicionalmente al uso de cepas de Saccharomices cerevisiae para el crecimiento y la producción de etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos.

Antecedentes de la invención

Debido a la baja contribución neta a la producción de dióxido de carbono, el etanol producido a partir de fuentes renovables, como la lignocelulosa, es considerada una alternativa atractiva para sustituir parcialmente los combustibles fósiles (1). Muchas fuentes de materiales lignocelulósicos (por ejemplo, madera, residuos forestales y residuos agrícolas) pueden ser potencialmente usadas para la producción de etanol (2). Sin embargo, antes de la fermentación, la celulosa y la hemicelulosa en la lignocelulosa deben ser convertidas en azúcares monómeros mediante una combinación de tratamientos físicos (por ejemplo, trituración, explosión con vapor de agua), químicos (por ejemplo, ácidos diluidos) y quizás también enzimáticos. Además de los azúcares monómeros, se forman también un cierto número de otros compuestos durante estos procedimientos, varios de los cuales son potentes inhibidores. Ejemplos de estos compuestos son ácidos carboxílicos, furanos y compuestos fenólicos (3, 4, 5, 6, 7). El microorganismo usado para la fermentación de los hidrolizados consecuentemente debe exhibir tres características: a) debe tener una elevada tolerancia al etanol, b) debe ser resistente a los inhibidores que se encuentran en el hidrolizado y c) debe tener una amplia gama de utilización en sustratos, ya que el hidrolizado contiene diversos azúcares diferentes. Los azúcares cuantitativamente más importantes en el hidrolizado de abeto son glucosa, manosa y xilosa (6).

Debido a su elevado rendimiento de etanol, productividad específica elevada y elevada tolerancia al etanol, la Saccharomices cerevisiae es el microorganismo preferido para la conversión de hidrolizado en etanol. Se ha mostrado también que esta especie de levadura es más tolerante a inhibidores como ácido acético, furfural y 5-hidroxi-metil-furfural (HMF) que otros diversos microorganismos de producción potencial (8). En articular, la tolerancia a muchos compuestos de aldehídos puede ser explicada lo más probablemente por medio de una bioconversión de estos compuestos mediante la levadura en general, en los correspondientes alcoholes menos inhibidores. Por ejemplo, es conocido que la S. cerevisiae convierte furfural en un alcohol furfurílico (9, 10) menos inhibidor. Con respecto a la utilización de azúcares, la S. cerevisiae convierte eficazmente tanto glucosa como manosa en etanol, pero es incapaz de convertir xilosa en etanol. Otras especies de levaduras, por ejemplo Pichia stipitis y Candida shehatae, son capaces de convertir xilosa en etanol. Sin embargo, estas levaduras tienen una tolerancia relativamente baja al etanol y el inhibidor y, además de ello, requieren condiciones microaeróbicas con el fin de proporcionar una productividad elevada (8, 11). Consecuentemente, se ha llevado a cabo un trabajo para tratar por ingeniería genética la S. cerevisiae con el fin de obtener una capacidad fermentadora de xilosa. En las levaduras que metabolizan la xilosa, la xilosa es canalizada en la trayectoria de pentosa fosfato (PPP) en un procedimiento en tres etapas. La xilosa es convertida en primer lugar en xilitol mediante una xilosa reductasa (XR). El xilitol es seguidamente oxidado en xilulosa por medio de xilitol deshidrogenasa (XHD y, finalmente, la xilulosa es fosforilada a 5-fosfato de xilulosa por medio de xilulosa quinasa (XK) (12). A las dos primeras enzimas les falta S. cerevisiae. Además de ello, la actividad de XK en S. cerevisiae se ha mostrado que es baja (3), lo que ha sugerido que limita la velocidad de consumo en cepas de S. cerevisiae que expresan XR y XDH (14). Sin embargo, el fondo de la cepa parece que es importante para el efecto de XK (15, 16). En el presente trabajo, se estudió una cepa genéticamente modificada que utiliza xilosa de S. cerevisiae: TMB3006 (17). Esta cepa expresa los genes heterólogos XYL1 y XYL2 (que codifican las enzimas XR y XDH, respectivamente) de P. stipitis y sobreexpresan el gen nativo XKS1 (que codifica XK).

Se ha mostrado previamente que los hidrolizados en ácidos diluidos fuertemente inhibidores, no fermentables en un procedimiento discontinuo pueden ser fermentados por medio de S. cerevisiae sin una destoxificación anterior en una operación de alimentación discontinua. Sin embargo, esto requiere una velocidad de alimentación cuidadosamente controlada del hidrolizado (18, 19, 20). La explicación más probable para el éxito de la operación de alimentación discontinua es que los inhibidores son mantenidos a bajos niveles debido a su conversión en compuestos menos tóxicos. En el desarrollo de una estrategia de control de bucle cerrado para la fermentación de alimentación discontinua, se usó la cepa de CBS 8066 (21) de S. cerevisiae. Es conocido que las diferentes cepas de S. cerevisiae muestran diferencias significativas en la capacidad fermentadora y la tolerancia a inhibidores en un cultivo discontinuo. En muchos trabajos de Carlos et al. (22) se encontraron diferencias significativas en la producción de etanol de diversas cepas en cultivos discontinuos con diferentes niveles de una combinación de inhibidores en medios sintéticos. Solamente 3 de 13 cepas ensayadas produjeron etanol en una fermentación discontinua con el nivel más elevado de la combinación de inhibidores. No solamente es importante el rendimiento en el cultivo discontinuo, sino que lo es más incluso el rendimiento en el cultivo de alimentación discontinua para la selección de una cepa adecuada. Aparte de la posibilidad de controlar el nivel de diversos inhibidores potenciales, la operación de alimentación discontinua ofrece otra ventaja en comparación con la operación discontinua, que es la posibilidad de una absorción paralela de diversos azúcares. La razón es que la concentración de azúcares puede ser mantenida a un nivel bajo controlando la velocidad de alimentación. De esta forma, puede ser evitada la saturación de sistemas de absorción (o saturación del flujo glicolítico) haciendo posible la co-fermentación de diferentes azúcares. En la S. cerevisiae, la xilosa se cree que es transportada por el mismo sistema de absorción que la glucosa, sin embargo, con una afinidad mucho más baja (23). Es conocido también que una absorción concomitante de glucosa aumenta la velocidad de consumo de xilosa (24). Por lo tanto, se puede anticipar que se puede obtener una velocidad más elevada de conversión específica de xilosa en hidrolizados en cultivos de alimentación discontinua.

Larroy, C., M. R. Fernandez, G. E, X. Pares and J. A. Biosca. 2002. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae YMR318C (ADH6) gene product as a broad specificity NADPH-dependant alcohol dehydrogenase: relevance in aldehyde reduction. Biochem J. 361:163-172 (38) han caracterizado la enzima ADHWI y ha ensayado sus características cinéticas para diversos sustratos, principalmente aldehídos alifáticos y aromáticos. En su trabajo, los autores se han concentrado principalmente en los aldehídos aromáticos (cinamaldehído y veratraldehído). Los autores sugieren que la ADHVI puede dar oportunidad a que la levadura sobreviva en entornos ligninolíticos en los que pueden estar disponibles los productos derivados de la biodegradación de la lignina. Sin embargo, no se han hecho ensayos relativos a la capacidad de la ADHVI de usar HMF como un sustrato, siendo HMF un producto derivado de hidratos de carbono. Además de ello, el documento no expone ni investiga experimentalmente la función potencial de la ADHVI en la protección o la conversión de los inhibidores que resultan de la descomposición de hidratos de carbono como celulosa y/o hemicelulosa. Larroy solamente describe la transformación de la cepa de levadura... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae productora de etanol CEN.PK 113-5D, que es capaz de crecer y producir etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos, que comprende compuestos inhibidores del crecimiento del grupo furfural y 5-hidroxi-metil-furfural, en una fermentación discontinua, de alimentación discontinua o continua, cepa que está sobre-regulada y/o sobreexpresada con respecto al gen ADH6, en que la alcohol deshidrogenasa es dependiente de NADPH.

2. Uso de una cepa de Saccharomyces cerevisiae productora de etanol para crecer y producir etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos, que comprende compuestos inhibidores del crecimiento del grupo furfural y 5-hidroxi-metil-furfural en una fermentación discontinua, de alimentación discontinua o continua, cepa que está sobre-regulada y/o sobreexpresada con respecto al gen ADH6, en que la alcohol deshidrogenasa es dependiente de NADPH.

3. Uso según la reivindicación 2, en que dicha cepa de Saccharomyces cerevisiae es CEN.PK 113-5D.

4. Uso según la reivindicación 2 ó 3, para la reducción furfural.