Un polipéptido aislado que comprende como mucho diez aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos expuesta como MSARVRSRSRGRGDGX1X2APDVVAFVAPGESQQEEPPTDNQDIEPGQEREGTPPIEERKX3X4GDCQEMDX5EKTR SERGDGSDVKEX6X7PPNPKHX8KTKEAGDGQP (SEC ID Nº 1) y comprendiendo el polipéptido uno de (a) los aminoácidos 16 a 25 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X1) es una glutamina y el aminoácido 2 (X2) es una leucina;

(b) los aminoácidos 16 a 25 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X1) es una tirosina y el aminoácido 2 (X2) es una leucina; (c) los aminoácidos 59 a 68 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X3) es una valina y el aminoácido 2 (X4) es una leucina; (d) los aminoácidos 59 a 68 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X3) es una tirosina, el aminoácido 2 (X4) es una leucina, y el aminoácido 3 (X5) es una valina, o (e) los aminoácidos 84 a 92 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X6) es una tirosina, el aminoácido 2 (X7) es una leucina y el aminoácido 9 (X8) es una valina

CAMPO

Esta solicitud se refiere al campo de agentes terapéuticos contra el cáncer, específicamente a péptidos inmunogénicos y su uso en el tratamiento de cáncer de próstata, cervical, uterino y testicular. 5

ANTECEDENTES

El cáncer de próstata es el cáncer más habitualmente diagnosticado en los hombres y es la segunda causa más común de muerte por cáncer (Carter y Coffey, Prostate 16:39-48, 1990; Armbruster et al., Clinical Chemistry 39:181, 1993). Si se detecta en una fase temprana, el cáncer de próstata es potencialmente curable. Sin embargo, la mayoría de los casos se diagnostican en fase tardías cuando ya ha sucedido la metástasis del tumor primario (Wang 10 et al., Meth. Cancer Res. 19:179, 1982). Incluso el diagnóstico temprano es problemático porque no todos los individuos que dan positivo en el positivo en estas exploraciones desarrollan cáncer.

El tratamiento actual para el cáncer de próstata incluye prostatectomía radical, radioterapia, o terapia hormonal. Con intervención quirúrgica, no siempre se consigue la erradicación completa del tumor y la re-aparición observada del cáncer (12-68%) depende de la fase del tumor clínico inicial (Zietman et al., Cancer 71:959, 1993). 15 Por tanto, son deseables métodos alternativos de tratamiento incluyendo profilaxis o prevención.

Los cánceres de próstata, testicular, y uterino, habitualmente se tratan, en parte, por la eliminación quirúrgica del órgano afectado. Hasta el 30% de los pacientes de los Estados Unidos con cáncer en fase temprana potencialmente curable, tal como cáncer de próstata, fallarán en cirugía convencional o radioterapia en 2004. Además, los pacientes con cáncer de próstata metastático disfrutan de un beneficio limitado de la quimioterapia 20 convencional y las terapias basadas en hormonas. Las metástasis, sin embargo, pueden no ser susceptibles a eliminación quirúrgica, o pueden ser demasiado pequeñas para detectarse fácilmente. La potenciación de la respuesta inmune del paciente contra el cáncer; y particularmente la potenciación de la respuesta de linfocitos T citotóxicos ("CTL") contra el cáncer, pueden ayudar en la ralentización o detención del progreso de la enfermedad.

La inmunoterapia puede tener gran potencial para mejorar estos resultados, combinado la especificidad de 25 tumor de la inmunidad mediada por células con la libertada de las quimioterapias tóxicas.

La inmunoterapia implica provocar una respuesta inmune contra las células cancerosas en base a su producción de antígeno diana. La inmunoterapia basada en respuestas inmunes mediadas por células implica generar una respuesta inmune mediada por células contra células que producen determinantes antigénicos particulares, mientras que la inmunoterapia basada en respuestas inmunes humorales implica generar anticuerpos 30 específicos contra células que producen determinantes antigénicos particulares.

Estudios recientes muestran que la inmunoterapia de pacientes con cáncer puede mejorarse drásticamente por el hallazgo de que las CTL CD8+ reconocen y eliminan las células tumorales que presentan péptidos de antígenos asociados con tumores dentro de las moléculas MHC de clase I. En estudios clínicos se ha descubierto que las células T CD8+ efectoras desempeñan una tarea principal en la regresión tumoral. Se han identificado varios 35 antígenos tumorales en modelos de cáncer de próstata y se han identificado los péptidos específicos de alelo HLA a partir de esos antígenos asociados con cáncer de próstata como epítopos de células T CD8+. Por ejemplo, se describieron péptidos de unión a HLA-A2.1 que se obtuvieron del antígeno específico de próstata (PSA) (Correale et al., J Immunol 161:3186, 1998), el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) (Tjoa et al., Prostate 28:65, 1996), el antígeno de células madre prostáticas (PSCA) (Kiessling et al., Int J Cancer 102:390, 2002), y la fosfatasa 40 ácida de próstata (Peshwa et al., Prostate 36:129, 1998). Para PSA, están en progreso ensayos clínicos que usan diferentes estrategias de vacuna. Sin embargo, hay claramente una necesidad de identificar antígenos adicionales para ayudar en el diagnóstico de un cáncer de un órgano reproductor, y para su uso como agentes terapéuticos adicionales.

El documento WO 00/12706 describe PAGE-4 y usos 45

SUMARIO

La invención se define en las reivindicaciones.

El gen PAGE4 se expresa en tejidos reproductores, y se expresa en cánceres reproductores, tales como cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical y cáncer testicular. En este documento se describen polipéptidos PAGE4 inmunogénicos. Estos polipéptidos pueden usarse en ensayos de diagnóstico para la expresión de PAGE4, 50 así como para inducir una respuesta inmune contra PAGE4.En este documento se proporcionan polinucleótidos que codifican los polipéptidos PAGE4 inmunogénicos, vectores que incluyen estos polipéptidos, células hospedadoras transformadas con estos vectores, y métodos para usar estos polipéptidos, polinucleótidos, vectores, y células hospedadoras.

Se describen polipéptidos PAGE4 inmunogénicos, tales como un polipéptido aislado que incluye como 55 mucho diez aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos expuesta como

MSARVRSRSRGRGDGX1X2APDVVAFVAPGESQQEEPPTDNQDIEPGQEREGTPPIEERKX3X4GDCQEMDX5EKTRSERGDGSDVKEX6X7PPNPKHX8KTKEAGDGQP (SEC ID Nº 1, PAGE4 CONSENSO QUE MUESTRA SUSTITUCIONES)

donde X1 es Q o Y, X2 es E o L, X3 es V o Y, X4 es E o L, X5 es V o L, X6 es K o Y, X7 es T o L, y X8 es A o 60

V. El polipéptido incluye uno de (a) los aminoácidos 16 a 25 de la SEC ID Nº 1, (b) los aminoácidos 59 a 68 de la SEC ID Nº 1, o (c) los aminoácidos 84 a 92 de la SEC ID Nº 1.

Se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos PAGE4 inmunogénicos, así como vectores de expresión que incluyen estos ácidos nucleicos. Estos vectores incluyen vectores virales, tales como, aunque sin limitación, vectores poxvirales. También se proporcionan células 5 hospedadoras transformadas con estos vectores. En una realización, se describe una composición que incluye un primer virus recombinante que ha incorporado en un genoma viral o parte infectable del mismo un ácido nucleico que codifica el polipéptido PAGE4 inmunogénico y un segundo virus recombinante que ha incorporado en un genoma viral o parte infectable del mismo uno o más genes o secuencias de ADN que codifican B7-1, B7-2, o B7-1 y B7-2, donde la composición es capaz de co-infectar una célula hospedadora provocando la co-expresión del 10 polipéptido y los genes o secuencias de ADN que codifican B7-1, B7-2, o B7-1 y B7-2.

También se proporcionan métodos para diagnostica un cáncer de expresión de PAGE4, tal como un cáncer reproductor, que incluyen el uso de los polipéptidos PAGE4 inmunogénicos descritos o los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos. Los cánceres ejemplares incluyen cáncer de próstata, uterino, o testicular.

También se describen métodos para inducir una respuesta inmune contra PAGE4. Los métodos incluyen el 15 uso de los polipéptidos PAGE4 inmunogénicos descritos en este documento, los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos, y/o vectores virales que codifican un polipéptido PAGE4 inmunogénico, solo o junto con otros agentes, tales como B7-1, B7-2, y/o una citoquina y/o con terapias tradicionales contra el cáncer, tales como cirugía, radioterapia y/o quimioterapia. También se describen métodos para tratar a un sujeto con un tumor, tal como cánceres reproductores, por ejemplo, cáncer de próstata, uterino, o testicular. 20

Las características y ventajas anteriores y otras llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones, que procede con referencia a las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las FIG. 1A y 1B son gráficos lineales que muestran la unión de péptidos PAGE4 nativos y sus péptidos agonistas a moléculas HLA-A2. Los péptidos se analizaron para la unión a la línea celular T2 como se describe en el 25 Ejemplo 1. Para los resultados presentados en la FIG. 1A, los péptidos se usaron a concentraciones de 0 a 25 g/ml. Péptido P16 (○), P16-1 (●), P16-2 (▲), P84 (□) y P84-1 (■),control positivo (péptido MUC-1) (+) y control negativo (péptido de unión a HLA-A3) (X). Los... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende como mucho diez aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos expuesta como

MSARVRSRSRGRGDGX1X2APDVVAFVAPGESQQEEPPTDNQDIEPGQEREGTPPIEERKX3X4GDCQEMDX5EKTRSERGDGSDVKEX6X7PPNPKHX8KTKEAGDGQP (SEC ID Nº 1) 5

y comprendiendo el polipéptido uno de

(a) los aminoácidos 16 a 25 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X1) es una glutamina y el aminoácido 2 (X2) es una leucina;

(b) los aminoácidos 16 a 25 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X1) es una tirosina y el aminoácido 2 (X2) es una leucina; 10

(c) los aminoácidos 59 a 68 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X3) es una valina y el aminoácido 2 (X4) es una leucina;

(d) los aminoácidos 59 a 68 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X3) es una tirosina, el aminoácido 2 (X4) es una leucina, y el aminoácido 3 (X5) es una valina, o

(e) los aminoácidos 84 a 92 de la SEC ID Nº 1 donde el aminoácido 1 (X6) es una tirosina, el aminoácido 2 15 (X7) es una leucina y el aminoácido 9 (X8) es una valina.

2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1, unido preferiblemente de forma funcional a un promotor.

3. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.

4. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3, siendo el vector un vector plasmídico o un vector viral. 20

5. Un vector de acuerdo con la reivindicación 4, siendo el vector un vector plasmídico que se expresa en Salmonella o un vector plasmídico que se expresa en levaduras.

6. Un vector de acuerdo con la reivindicación 4, siendo el vector un vector viral.

7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 6, siendo el vector viral un vector de retrovirus, orthopoxvirus, avipoxvirus, fowlpoxvirus, capripoxvirus, suipoxvirus, adenovirus, herpesvirus, alfavirus, baculovirus, virus Sindbis, 25 virus vaccinia o poliovirus.

8. Una composición que comprende un primer virus recombinante que tiene incorporado en un genoma viral o parte infectable del mismo un ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado de la reivindicación 1 y un segundo virus recombinante que tiene incorporado en un genoma viral o parte infectable del mismo uno o más genes o secuencias de ADN que codifican una molécula co-estimuladora, siendo capaz la composición de co-infectar una 30 célula hospedadora provocando la co-expresión del polipéptido y los genes codificantes o las secuencias de ADN que codifican la molécula co-estimuladora.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la molécula co-estimuladora uno o más de B7-1, B7-2, LFA o ICAM-1.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en la que el segundo virus recombinante 35 comprende adicionalmente una o más secuencias de ADN exógenas que codifican una o más moléculas inmunoestimuladoras, en la que la molécula inmunoestimuladora se selecciona entre el grupo compuesto por IL-2, ICAM-1, LFA-3, CD72, GM-CSF, TNF-, IFN-, IL-12, e IL-6.

11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8, 9 ó 10, comprendiendo adicionalmente la composición una cantidad eficaz para la inmunomodulación de al menos uno de una molécula inmunoestimuladora exógena 40 seleccionada entre el grupo compuesto por IL-2, GM-CSF, TNF-, IL-12, e IL-6.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende el primer y segundo virus en cantidades eficaces para mejorar una enfermedad en un mamífero, siendo la enfermedad un cáncer.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que el cáncer es cáncer uterino, cervical, de próstata o testicular. 45

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la que el primer virus recombinante, el segundo virus recombinante, o el primer y segundo virus recombinantes se seleccionan entre el grupo compuesto por vectores de retrovirus, vectores de orthopoxvirus, vectores de avipoxvirus, vectores de fowlpoxvirus, vectores de capripoxvirus, vectores de suipoxvirus, vectores adenovirus, vectores de herpesvirus, vectores de alfavirus, vectores de baculovirus, vectores de virus Sindbis, vectores de virus vaccinia y vectores de poliovirus, preferiblemente virus 50 vaccinia o fowlpoxvirus.

15. Una célula hospedadora transformada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

16. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 15, siendo la célula hospedadora una célula dendrítica o una célula tumoral.

17. Una composición farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula hospedadora de la reivindicación 15 ó 16 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la 5 reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polinucleótido de la reivindicación 2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. El polipéptido de la reivindicación 1 para su uso en un método para provocar una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, preferiblemente 10 con un adyuvante, produciendo de este modo una respuesta inmune en el sujeto.

22. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 para su uso en un método para potenciar una respuesta inmune contra células que expresan PAGE4 en un mamífero, que comprende infectar las células in vitro con una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición, para producir que las células infectadas expresen un polipéptido PAGE4 inmunogénico y administrar una cantidad de células infectadas a un mamífero afectado con 15 células que expresan la proteína PAGE4, potenciado de este modo la respuesta inmune.

23. La composición de la reivindicación 22, siendo la composición administrable con un adyuvante.

24. La composición de la reivindicación 22 ó 23, en la que las células son células dendríticas o células tumorales.

25. El polinucleótido de la reivindicación 2 para su uso en un método para provocar una respuesta inmune en 20 un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del polinucleótido, produciendo de este modo una respuesta inmune en el sujeto.

26. El polinucleótido de la reivindicación 25, en el que la composición es administrable con un adyuvante.

27. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 para su uso en un método para tratar a un sujeto con cáncer, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del vector, 25 tratando de este modo al sujeto.

28. El vector de la reivindicación 27, siendo el vector un vector viral recombinante.

29. El vector de la reivindicación 28, comprendiendo adicionalmente el vector viral recombinante un ácido nucleico que codifica una molécula co-estimuladora, preferiblemente siendo la molécula co-estimuladora B7-1, B7-2, B7-1 B7-2, LFA e ICAM-1. 30

30. El polipéptido, polinucleótido o vector de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, comprendiendo adicionalmente el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-, IFN-, IL-15, IFN-, G-CSF, o una combinación de los mismos.

31. El polipéptido, polinucleótido o vector de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, comprendiendo adicionalmente el método administrar al sujeto un ácido nucleico que codifica uno o más de IL-2, RANTES, GM-CSF, 35 TNF-, IFN-, IFN-, IL-15, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 41 BBL e ICAM-1.

32. El polipéptido, composición, polinucleótido o vector de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 31, comprendiendo la respuesta inmune una respuesta de células T.

33. El polipéptido, composición, polinucleótido o vector de la reivindicación 32, comprendiendo la respuesta inmune inducir células T citotóxicas que inducen la lisis de células que expresan la SEC ID Nº 1. 40

34. El polipéptido, composición, polinucleótido o vector de la reivindicación 33, teniendo el sujeto cáncer, siendo el cáncer más particularmente cáncer uterino, cervical, de próstata o testicular.

35. El polipéptido, composición, polinucleótido o vector de la reivindicación 34, disminuyendo la respuesta inmune el crecimiento del cáncer.

36. El polipéptido, composición, polinucleótido o vector de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 35, 45 comprendiendo adicionalmente el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico al sujeto.

37. El vector de la reivindicación 27, 28 ó 29, siendo el vector administrable como parte de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14.

38. El polipéptido de la reivindicación 1 para su uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula 50 cancerosa de próstata, comprendiendo el método,

(i) cultivar linfocitos T citotóxicos (CTL) o células precursoras CTL con el polipéptido y una célula presentadora de antígeno para producir CTL activados o CTL madurados a partir de los precursores CTL que reconocen las células cancerosas de próstata, y

(ii) poner en contacto la célula de cáncer de mama o de cáncer de próstata con los CTL activados o CTL madurados a partir de los precursores CTL,

inhibiendo de este modo el crecimiento de la célula cancerosa de próstata.

39. El polipéptido de la reivindicación 38, en el que la célula cancerosa está en un sujeto, y el método comprende administrar los linfocitos T citotóxicos al sujeto. 5

40. El polipéptido de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa reproductora en un sujeto, comprendiendo el método,

poner en contacto una célula dendrítica con el polipéptido, o expresar el polinucleótido en las células dendríticas, preparando de este modo una célula presentadora de antígeno específica, y

administrar la célula presentadora de antígeno al sujeto, induciendo de este modo una respuesta inmune e 10 inhibiendo el crecimiento de la célula cancerosa reproductora.

41. El polipéptido de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa reproductora en un sujeto, comprendiendo el método,

poner en contacto una célula dendrítica con el polipéptido, o expresar el polinucleótido en las células dendríticas, preparando de este modo una célula presentadora de antígeno específica, y 15

poner en contacto la célula presentadora de antígeno con una población de células T citotóxicas, produciendo de este modo células T citotóxicas activadas; y administrar las células T citotóxicas activadas al sujeto.

42. El polipéptido o polinucleótido de la reivindicación 41, siendo el cáncer reproductor un cáncer de próstata, de cuello del útero, testicular, o uterino.

43. Un método para detectar células T que expresan CD8 que reconocen específicamente la SEC ID Nº 1 en 20 un sujeto, que comprende

poner en contacto células mononucleares de sangre periférica aisladas del sujeto con el reactivo que comprende el polipéptido de la reivindicación 1;

detectar la presencia del reactivo unido a las células mononucleares de sangre periférica, detectando de este modo las células T que expresan CD8 que se unen específicamente a la SEC ID Nº 1. 25