NUEVOS PÉPTIDOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ESQUIZOFRENIA.

La presente invención se refiere a un ensayo para el diagnóstico de la esquizofrenia y proporciona nuevos péptidos para su uso en el ensayo. Técnica anterior La siguiente es una lista de las publicaciones destinadas a una mejor comprensión de los antecedentes de la invención. El reconocimiento en el presente documento de la técnica anterior no debe interpretarse como una indicación de que esta técnica sea, en modo alguno, relevante para la patentabilidad de la invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Carpenter, W.T., y Buchanan, R.W.: Revisión, N. England., J. Med., 330:681-690, 1994. Deckmann, M., Shinitzky, M., Leykin, I., Cheng, D., Guy, J., Avnon, M., Salganik, I., Amiri, Z., Schlossberg, A., Leibu, E. y Rafael, C.: The Italian J. Psychiatr. Behav. Sci., 6:29-34, 1996. DeLisi, L.E. y Crow, T.J.: Psychiatr. North Am., 9:115-132, 1987. Rotman, A.: Blood platelets in psychopharmacological research. Prog. Neuropsychopharmacol., 6:135-151, 1983. Shinitzky, M., Deckmann, M., Kessler, A., Sirota, P., Rabbs, A., y Elizur, A.: Ann. N. Y. Acad. Sci., 621:205-217, 1991. Shinitzky, M. y Deckmann, M., "Diagnosis of the susceptibility of contracting schizophrenia", Patente US No. 6,008,001, 1999. Shinitzky, M. y Deckmann, M., "Assay for schizophrenia based on skin reaction" WO 99/30163, 1999. Shinitzky, M. y Deckmann, M., "Assay for the diagnosis of schizophrenia based on a new peptide" WO 99/51725, 1999. Antecedentes de la invención ES 2 365 389 T3 La esquizofrenia es un síndrome que engloba una variedad de síntomas mentales, tales como alucinaciones auditivas, paranoia, delirio, catatonia, comportamiento extraño y retraimiento emocional. La esquizofrenia afecta aproximadamente al 1% de la población total y su carga económica, así como social, en la sociedad, son enormes. El inicio de la enfermedad se presenta a una edad temprana y, de esta manera, los pacientes necesitan, típicamente, supervisión médica y psiquiátrica durante toda su vida. Por lo tanto, la esquizofrenia se considera como una de las enfermedades más costosas en el mundo industrial (Carpenter, et al., 1994). No se han identificado parámetros comunes asociados con la esquizofrenia y, por lo tanto, el diagnóstico de esta enfermedad, acordado a nivel internacional, se basa todavía, a día de hoy, únicamente en una evaluación psiquiátrica. Los factores de riesgo conocidos, asociados con la esquizofrenia, son la predisposición genética, el nacimiento durante el invierno y las complicaciones durante el embarazo o el parto. Las infecciones virales y / o bacterianas con una reacción autoinmune subsiguiente se han propuesto como factores causantes de la epidemia creciente de esquizofrenia (DeLisi, et al., 1987). Se ha demostrado que la esquizofrenia implica un proceso autoinmune y recientemente se ha demostrado la implicación de anticuerpos y células T citotóxicas contra plaquetas en pacientes esquizofrénicos (Shinitzky, 1991, Deckmann, 1996, Shinitzky, 1999, Patente US 6.008.001). La reacción de las células T citotóxicas en pacientes esquizofrénicos se evaluó mediante un ensayo cutáneo en el que la mayoría de pacientes esquizofrénicos reaccionaron positivamente contra sus plaquetas autólogas, mientras que sólo un número muy pequeño de individuos no esquizofrénicos ensayados reaccionó positivamente en este ensayo (Shinitzky, 1999, W099/30163). Además, se observaron elevados niveles de autoanticuerpos contra plaquetas en pacientes esquizofrénicos, pero no en pacientes que sufren trastorno maníaco-depresivo, depresión, trastornos de la personalidad y trastorno esquizoafectivo (Shinitzky, 1991 y Deckmann, 1996). En el trabajo previo de los presentes inventores, se identificaron varias proteínas que se unen a autoanticuerpos que se encuentran en niveles elevados en los fluidos corporales de los pacientes esquizofrénicos (Shinitzky et al., 1999, WO 99/51725). Estas proteínas reaccionaron con autoanticuerpos purificados derivados de plaquetas (PAA) de pacientes esquizofrénicos, pero no podían diferenciar entre muestras de plasma o sangre de individuos esquizofrénicos y no esquizofrénicos. La digestión enzimática de una de estas proteínas, la enzima Enolasa, dio lugar a un fragmento que se 2 une a las muestras de plasma de los pacientes esquizofrénicos de una manera sustancialmente mayor de lo que se une a las muestras de plasma de individuos no esquizofrénicos. En base a este fragmento, se sintetizaron varios péptidos adicionales y se aislaron aquellos que tenían una actividad de unión alta a PAA de individuos esquizofrénicos. Se encontró que a estructura del epítopo antigénico de estos péptidos era un epítopo tri-dimensional que, mediante el uso de un programa informático, se predijo que tendría una estructura cíclica que comprende un núcleo hidrófobo y una extensión que tiene aproximadamente dos cargas positivas. Los estudios inmunológicos demostraron que sólo la forma cíclica oxidada del péptido era reactiva con los autoanticuerpos anti-plaquetas. Estos péptidos sintetizados comprendían al menos 17 aminoácidos (a.a.). Resumen de la invención Según la presente invención, se ha descubierto que las secuencias peptídicas descritas en la técnica anterior (WO 99/51725) son capaces de unirse en un mayor grado a autoanticuerpos que se encuentran en niveles elevados en los fluidos corporales de pacientes esquizofrénicos y en un menor grado o en absoluto en los fluidos corporales de individuos no esquizofrénicos, pero estos péptidos no pueden ser el sitio de unión natural de dichos autoanticuerpos. Esto se debe al hecho de que las secuencias no están expuestas en la superficie de la proteína de la que fueron derivadas (la enzima enolasa). A excepción del único aminoácido arginina en la posición 402, el resto de aminoácidos están enterrados dentro de la proteína (véase Fig. 1). Además, tal como se conoce, un sitio de unión de anticuerpos comprende, por lo general, aproximadamente 5-8 a.a., mientras que cada uno de estos péptidos comprendía 17 a. a., que no son necesarios, todos ellos, para el sitio de unión. Por lo tanto, según la presente invención, en base a la comprensión de que el péptido, que es el sitio de unión natural para los autoanticuerpos que se encuentran en niveles elevados en los pacientes esquizofrénicos tendrá una unión más sensible y específica a dichos autoanticuerpos y, como tal, puede ser ventajoso en el diagnóstico de la esquizofrenia, se realizó un intento para identificar un sitio equivalente en la superficie de la enolasa mediante el uso de modelado tridimensional. El uso de la estructura tridimensional para buscar en la superficie de la enolasa, dio como resultado la identificación de un epítopo putativo (ver Fig. 2) que consiste en cuatro aminoácidos cargados positivamente, definidos como R414, R184, K194 y R402, que rodean a un grupo de aminoácidos neutros definidos como L412, L183, L409, L406, P400 y A401. Según la invención, se proporcionan péptidos que tienen un epítopo putativo. De esta manera, por su primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido que se une a una muestra de fluido corporal obtenida de un paciente esquizofrénico a un nivel sustancialmente más alto que su unión a una muestra de fluido corporal obtenida de un individuo no esquizofrénico, teniendo dicho péptido no más de 10 aminoácidos (a.a.) de largo y comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: i. LVVGLCK (SEQ ID NO. 1) ii. KLVVGLC (SEQ ID NO. 2) iii. LVVGLMK (SEQ ID NO. 3) iv. KLVVGLM (SEQ ID NO. 4); ES 2 365 389 T3 consistiendo dicha secuencia en al menos un a.a. cargado positivamente en un extremo de dicha secuencia, y comprendiendo dicho péptido al menos un a.a. cargado positivamente en su extremo, siendo el a.a. cargado positivamente de dicha secuencia continua. Un nivel de unión sustancialmente más alto, según la invención, se determinará mediante el uso de cualquiera de los ensayos de unión conocidos en la técnica, tales como los descritos a continuación y en los que el nivel de unión medido de un péptido a una muestra obtenida de un paciente esquizofrénico es significativamente mayor que el nivel de unión medido del mismo péptido a una muestra obtenida de un paciente no esquizofrénico, según se determina mediante un ensayo estadístico adecuado, por ejemplo, el ensayo T de Student. El término "secuencia continua" se refiere a una secuencia ininterrumpida de entre 5 y 7 a. a. de cualquiera de entre las secuencias SEQ. IDs 1 - 4, que incluye un a.a. cargado positivamente en su extremo. Preferentemente, el a.a. cargado positivamente es lisina (indicado como K en las secuencias), pero puede ser también arginina (R) o histidina (H). La secuencia continua puede ser parte de un péptido más largo de hasta 10 a.a., en el que la secuencia continua está situada... [Seguir leyendo]

1. Péptido que se une a una muestra de fluido corporal obtenida de un paciente esquizofrénico, en un nivel esencialmente más alto que su unión a una muestra de fluido corporal obtenida de un individuo no esquizofrénico, siendo dicho péptido de no más de 10 aminoácidos (a.a.) de largo y comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: i. LVVGLCK (SEQ ID NO. 1); ii. KLVVGLC (SEQ ID NO. 2); iii. LVVGLMK (SEQ ID NO. 3); y iv. KLVVGLM (SEQ ID NO.4); en el que dicha secuencia consiste en al menos un a.a. cargado positivamente en un extremo de dicha secuencia; y en el que dicho péptido comprende al menos un a.a. cargado positivamente en su extremo, siendo el a.a. cargado positivamente de dicha secuencia. 2. Péptido según la reivindicación 1, seleccionado de entre el grupo que consiste en: i. LVVGLCK (SEQ ID NO. 1); ii. KLVVGLC (SEQ ID NO. 2); iii. LVVGLMK (SEQ ID NO. 3); y iv. KLVVGLM (SEQ ID NO. 4). 3. Péptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos LVVGLCK (SEQ ID NO. 1). 4. Péptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido se une a anticuerpos que son capaces de unión específica a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos LVVGLCK (SEQ ID NO. 1). 5. Péptido según la reivindicación 4, que tiene la secuencia de aminoácidos KLVVGLC (SEQ ID NO. 2), LVVGLMK (SEQ ID NO. 3) o KLVVGLM (SEQ ID NO. 4). 6. Ensayo para el diagnóstico de esquizofrenia en un individuo, que comprende las etapas siguientes: (a) poner en contacto una muestra de fluido corporal de un individuo con un péptido de no más de 10 aminoácidos (a.a.) de largo y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: i. LVVGLCK (SEQ ID NO. 1); ii. KLVVGLC (SEQ ID NO. 2); iii. LVVGLMK (SEQ ID NO. 3); y iv. KLVVGLM (SEQ ID NO. 4); en el que dicha secuencia consiste en al menos un a.a. cargado positivamente en un extremo de dicha secuencia, y en el que dicho péptido comprende al menos un a.a. cargado positivamente en su extremo, siendo el a.a. cargado positivamente de dicha secuencia; y en el que dicha muestra de fluido corporal es una muestra de sangre, una fracción de la misma que contiene PAA, o una fracción que contiene anticuerpos asociados a plaquetas (PAA) derivados de las plaquetas; y (b) determinar el nivel de unión de dicho péptido a dicha muestra, un nivel esencialmente más alto que el nivel de unión de dicho péptido a una muestra obtenida de un individuo no esquizofrénico, lo que indica que dicho individuo ensayado tiene una alta probabilidad de tener esquizofrenia. 7. Ensayo según la reivindicación 6, en el que el péptido de la etapa (b) es seleccionado de entre el grupo que consiste en: ii. LVVGLCK (SEQ ID NO. 1); ii. KLVVGLC (SEQ ID NO. 2); ES 2 365 389 T3 iii. LVVGLMK (SEQ ID NO. 3); y iv. KLVVGLM (SEQ ID NO. 4). ES 2 365 389 T3 8. Ensayo según la reivindicación 6, en el que el péptido de la etapa (a) tiene la secuencia de aminoácidos LVVGLCK (SEQ ID NO. 1). 5 9. Ensayo según la reivindicación 6, en el que el péptido en la etapa (a) es tal que se une a los anticuerpos que se unen a péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos LVVGLCK (SEQ ID NO. 1). 10. Kit para su uso en el diagnóstico de la esquizofrenia, que comprende un soporte que comprende uno o más péptidos según la reivindicación 1, inmovilizados sobre el mismo, anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (hIg) o un fragmento del mismo, reactivos que llevan a cabo un ensayo de detección, mediante el cual dichos péptidos se unen 10 a los anticuerpos presentes en una muestra ensayada, así como instrucciones de uso. 11. Kit según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo anti-hIg forma un complejo con un marcador detectable. 12. Kit según la reivindicación 10, en el que en lugar de dicho anticuerpo anti-hIg, el kit comprende uno o más péptidos no unidos que se unen a los anticuerpos presentes en una muestra ensayada, dichos péptidos formando complejos con un marcador detectable. 15 13. Uso de cualquiera de los péptidos según la reivindicación 1 para la preparación de una composición de diagnóstico para el diagnóstico de esquizofrenia en un individuo. 14. Ensayo según la reivindicación 6, para su uso en la confirmación de una alta probabilidad de esquizofrenia en un individuo, determinada mediante al menos otro ensayo diagnóstico. 11 ES 2 365 389 T3 12 ES 2 365 389 T3 13 ES 2 365 389 T3 14 ES 2 365 389 T3