MUTANTE DE GLICOSILACIÓN DE LA FSH.

La presente invención se refiere a polipéptidos que exhiben actividad de la hormona estimulante de los folículos, a métodos para preparar tales polipéptidos, y el uso de tales polipéptidos en terapia, en particular en el tratamiento de desórdenes reproductivos. 2. Descripción de la técnica relacionada a. Gonadotropinas La hormona estimulante de los folículos (FSH) es un miembro de la familia de las gonadotropinas que juega papeles clave en la fertilidad humana. Las gonadotropinas, que también incluyen la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG), son heterodímeros, que consisten cada una en una subunidad común (92 aminoácidos) y una subunidad única (111 aminoácidos en la FSH). Las secuencias de aminoácidos de las formas maduras de las subunidades y se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEC ID Nº: 2, respectivamente. La FSH humana ha sido aislada de las glándulas pituitarias y de la orina postmenopáusica (patente europea EP 322.438) y ha sido producida de manera recombinante en células de mamíferos (patentes de EE.UU. 5.639.640, 5.156.957, 4.923.805, 4.840.896, 5.767.251, patentes europeas EP 211.894 y EP 521.586). Estas últimas referencias también describen el gen de la subunidad de la FSH humana. La patente de EE.UU. 5.405.945 describe un gen de la subunidad humana modificado que comprende sólo un intrón. Liu et al. , J Biol Chem 1993, 15; 268 (2): 21613-7, Grossmann et al., Mol Endocrinol 1996 10 (6): 769-79, Roth y Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1; 109 (2): 143-9, Valove et al., Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61, Yoo et al., JBiol Chem 1993 25; 268 (18): 13034-42), patente de EE.UU. 5.508.261 y Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835 describen diversos estudios de relación estructura-función e identifican residuos de aminoácidos implicados en la unión con receptores y activación y en la dimerización de la FSH. b. Uso de gonadotropinas en técnicas de reproducción asistida Las gonadotropinas juegan papeles cruciales en el ciclo reproductivo, y su uso en terapias exógenas es esencial para las técnicas de reproducción asistida (TRA), tales como fertilización in vitro (FIV), FIV junto con inyección espermática intracitoplásmica (FIV/ICSI) y transferencia de embriones (TE), así como para la inducción de la ovulación (IO) en pacientes anovulatorias que se someten a fertilización in vivo bien de manera natural o bien mediante inseminación intrauterina (IIU). Las patentes de EE.UU 4.589.402 y 4.845.077 describen la FSH humana purificada que está exenta de LH y el uso de la misma para fertilización in vitro. La patente europea EP 322 438 describe una proteína con al menos 6200 U/mg de actividad FSH que está sustancialmente exenta de actividad LH, y en la que la subunidad y la subunidad de la FSH, respectivamente, pueden ser naturales o formas truncadas especificadas de las mismas. Es necesaria una terapia prolongada para conseguir un efecto terapéutico, típicamente durante 8-10 días consecutivos y a veces hasta 21 días para estimular la foliculogénesis en las mujeres, y durante hasta 18 meses en varones hipogonadotróficos para inducir la espermatogénesis. La hFSH recombinante se administra típicamente como una inyección diaria i.m. ó s.c., con la consiguiente incomodidad y una potencial reacción local en el sitio de inyección. Disminuir la frecuencia de administración facilitaría la terapia y haría que la administración de gonadotropinas fuera más conveniente, más tolerable y llevadera para el paciente. c. Glicosilación de la FSH ES 2 367 784 T3 Las gonadotropinas son glicoproteínas, teniendo cada subunidad cadenas laterales de oligosacáridos unidas a la asparagina (unidas a N) que son importantes para la actividad y función in vivo. La adición de carbohidratos (glicosilación) a polipéptidos es un evento post-translacional que da como resultado la adición de cadenas de azúcares a aminoácidos específicos de asparagina (unidos a N) o serina/treonina (unidos a O). En contraste con la invariante secuencia de aminoácidos de la porción proteínica de las glicoproteínas, las estructuras de los carbohidratos son variables, un rasgo denominado microheterogeneidad. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación sobre la misma proteína pueden contener diferentes estructuras de carbohidratos. Además, incluso en el mismo sitio de glicosilación sobre una glicoproteína dada, se pueden encontrar diferentes estructuras de carbohidratos. Esta heterogeneidad es una consecuencia de la síntesis de los carbohidratos no dirigida por plantillas . La N-glicosilación de proteínas se produce específicamente en el patrón de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, y en menor grado en el patrón de consenso Asn-Xaa-Cys, donde Xaa puede ser cualquier residuo de aminoácido. Sin embargo, 2 la presencia de un tripéptido de consenso no es suficiente para asegurar que se glicosilará un residuo de asparagina. Por ejemplo, la N-glicosilación de la secuencia Asn-Pro-Ser/Thr se produce con una tasa 50 veces más baja que los otros patrones de consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr. La FSH humana contiene cuatro sitios de glicosilación unidos a N: dos sobre la subunidad común en las posiciones 52 y 78 y dos sobre la subunidad en las posiciones 7 y 24. Los carbohidratos unidos a la subunidad de la FSH son críticos para el ensamblaje del dímero, la integridad, la secreción y transducción de señales, mientras que los carbohidratos de la subunidad son importantes para el ensamblaje del dímero, secreción y eliminación del heterodímero de la circulación. Galway et al., Endocrinology 1990; 127 (1): 93-100 demuestran que las variantes de la FSH producidas en una línea celular CHO de N-acetilglucosamina transferasa-I o una línea celular CHO defectiva en transporte de ácido siálico son tan activas como la FSH secretada por las células naturales o la FSH de la pituitaria purificada in vitro, pero carecen de actividad in vivo, presumiblemente debido a la rápida eliminación de las variantes inadecuadamente glicosiladas en el suero. D'Antonio et al., Human Reprod 1999; 14 (5): 1160-7 describen diversas isoformas de la FSH que circulan en la corriente sanguínea. Las isoformas tienen secuencias de aminoácidos idénticas, pero difieren en su grado de modificación post-translacional. Se encontró que el grupo de isoformas menos ácido tenía una eliminación in vivo más rápida en comparación con el grupo de isoformas ácido, debido posiblemente a diferencias en el contenido de ácido siálico entre las isoformas. Además, Bishop et al. Endocrinology 1995; 136 (6): 2635-40 concluyen que la vida media circulatoria parece ser el determinante principal de la actividad in vivo. Estas observaciones condujeron a la hipótesis de que la vida media de la FSH podría ser aumentada introduciendo sitios de glicosilación adicionales para aumentar el contenido de ácido siálico del polipéptido. d. Variantes de la FSH Se han desarrollado agonistas de la FSH con vidas medias aumentadas fusionando el péptido carboxiterminal de la hCG (CTP) a FSH humana recombinante nativa (rhFSH). EL resto CTP consiste en aminoácidos 112-118 a 145 con cuatro sitios de glicosilación unidos a O localizados en las posiciones 121,127, 132 y 138. Las patentes de EE.UU. 5.338.835 y 5.585.345 describen una subunidad de la FSH modificada extendida en el Glu C-terminal con el resto CTP de la hCG. Se afirma que el análogo modificado resultante tiene la actividad biológica de la FSH nativa, pero una vida media circulante prolongada. La patente de EE.UU. 5.405.945 describe que la parte carboxiterminal de la subunidad de la hCG o una de sus variantes tiene efectos significativos sobre la eliminación de CG, FSH y LH. La patente de EE.UU. 5.883.073 describe proteínas de cadena única que constan de dos subunidades con actividad agonista o antagonista para CG, TSH, LH y FSH. La patente de EE.UU. 5.508.261 describe polipéptidos heterodiméricos que tienen una afinidad a la unión a receptores de LH y FSH que comprenden una subunidad de hormona glicoproteínica y un polipéptido de la subunidad que ocurre no naturalmente, en el que el polipéptido de la subunidad es una cadena de aminoácidos que comprende cuatro subsecuencias unidas, cada una de las cuales se elige de una lista de secuencias específicas . Klein et al. (2003) describen un análogo de cadena única de la FSH con una vida media aumentada, en el que las subunidades y están unidas mediante un oligopéptido que contiene dos sitios de glicosilación unida a N. La solicitud de patente internacional WO 01/58493 describe 77 mutaciones que se pueden hacer en la subunidad de la FSH y 51 mutaciones que se pueden hacer en la subunidad de la FSH en un intento de mejorar la vida media in vivo de la FSH. La solicitud de patente internacional WO 01/58493 describe que las subunidades y se pueden usar individualmente (1 sitio de glicosilación adicional) o... [Seguir leyendo]

1. Una FSH recombinante, en la que la subunidad alfa de la FSH comprende la secuencia de SEQ ID NO:3 y en la que la subunidad beta de FSH comprende la secuencia de SEQ ID NO:4. 2. La FSH recombinante de la reivindicación 1, en la que N55 de la subunidad beta está glicosilada. 3. Un vector que codifica la subunidad alfa de la FSH que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y una subunidad beta de la FSH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4. 4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho vector es un vector de expresión. 5. Una célula aislada que comprende el vector de la reivindicación 4. 6. Una célula aislada que comprende un primer vector que comprende ADN que codifica una subunidad alfa de la FSH que comprende la secuencia de SEQ ID NO. 3 y un segundo vector que comprende ADN que codifica una subunidad beta de la FSH que comprende la secuencia de SEQ ID NO. 4. 7. La célula de la reivindicación 6, en la que el primer y segundo vectores son vectores de expresión. 8. La célula de la reivindicación 7, en la que la célula es una célula de mamífero. 9. Un método para producir un mutante de la FSH que comprende: (a) proporcionar células de mamífero, en las que las células comprenden un primer vector de expresión y un segundo vector de expresión; y (b) inducir la expresión del mutante de la FSH, en el que el primer vector de expresión codifica la subunidad alfa de la FSH que comprende la secuencia de SEQ ID NO. 3 y en el que el segundo vector de expresión codifica la subunidad beta de la FSH que comprende la secuencia de SEQ ID NO. 4. en el que las células son capaces de glicosilar proteínas. 10. Una composición que comprende la FSH recombinante de la reivindicación 1 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 11. Un mutante de la FSH recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en un método para tratar un animal infértil. 12. Un mutante de la FSH recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en un método para estimular la foliculogénesis en un mamífero. 13. Un mutante de la FSH recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en un método para inducir la hiperestimulación ovárica en un mamífero. 19 ES 2 367 784 T3 FIGURA 1 ES 2 367 784 T3 FIGURA 2 21 ES 2 367 784 T3 FIGURA 3 22 ES 2 367 784 T3 FIGURA 4 23 ES 2 367 784 T3 FIGURA 5 24