MICROCÁPSULAS ESFÉRICAS O NO ESFÉRICAS QUE COMPRENDEN PÉPTIDOS GLP-1, SU PRODUCCIÓN Y SU USO.

Microcápsula esférica que comprende como mínimo un revestimiento superficial y un núcleo,

en la que el como mínimo un revestimiento superficial comprende polímeros reticulados, donde el núcleo comprende polímeros reticulados y células transfectadas con y capaces de expresar y secretar un péptido de fusión que comprende GLP-1, o un fragmento o una variante del mismo, seleccionados de un péptido de fusión que comprende como componente (I) en el extremo N-terminal una secuencia de GLP-1(7-35, 7-36 ó 7-37), o un fragmento funcional o una variante de la misma, y como componente (II) en el extremo C-terminal una secuencia peptídica de al menos 9 aminoácidos y donde el péptido de fusión, sus fragmentos o variantes conservan la actividad biológica del GLP-1 nativo

La presente invención se refiere a microcápsulas esféricas que comprenden al menos un revestimiento superficial y un núcleo, donde el al menos un revestimiento superficial comprende polímeros reticulados, en las que el núcleo comprende polímeros reticulados y células transfectadas con y capaces de expresar y secretar un péptido de fusión que comprende GLP-1 o un fragmento o una variante del mismo seleccionados de un péptido de fusión que comprende como componente (I) en el extremo N-terminal una secuencia de GLP-1(7-35, 7-36 ó 7-37) o un fragmento funcional o una variante de la misma, y como componente (II) en el extremo C-terminal una secuencia peptídica de como mínimo 9 aminoácidos y donde el péptido de fusión, sus fragmentos o variantes conservan la actividad biológica del GLP-1 nativo.

La presente solicitud está dirigida a métodos para producir estas microcápsulas esféricas y al uso de estas microcápsulas, por ejemplo en el tratamiento de la diabetes tipo 2, trastornos de peso y enfermedades o estados asociados a los mismos, trastornos neurodegenerativos y enfermedades o estados asociados(as) a los mismos, o para el tratamiento de trastornos y enfermedades o estados asociados(as) a la apoptosis.

El gen del glucagón está bien estudiado, véase por ejemplo White, J.W. y col., 1986, Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730. La molécula del preproglucagón, como molécula precursora de alto peso molecular, se sintetiza en las células alfa pancreáticas y en las células L del yeyuno y colon. El preproglucagón es una prohormona de 180 aminoácidos de longitud y su secuencia contiene, además de glucagón, dos secuencias de estructura afín: péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) y péptido 2 similar al glucagón (GLP-2). En la molécula de preproglucagón, entre el GLP1 y el GLP-2, se halla una secuencia peptídica de 17 aminoácidos (o más bien una secuencia de 15 aminoácidos más el sitio de escisión RR C-terminal), el péptido interpuesto 2 (IP2). La secuencia de IP2 (situada entre el GLP-1 y el GLP-2 en la molécula precursora) se escinde normalmente por proteólisis después del aa 37 de GLP-1. Por tanto, la molécula del preproglucagón se escinde en distintos péptidos, dependiendo de la célula y del entorno, entre los que se incluye GLP-1 (1-37), un péptido de 37 aminoácidos en su forma no procesada. Por lo general, este procesamiento se realiza en el páncreas y el intestino. La secuencia del GLP-1 (1-37) puede continuar procesándose por proteólisis, dando como resultado GLP-1 activo (7-37), la forma procesada de 31 aminoácidos, o amida de GLP-1 (7-36). Por consiguiente, la designación GLP-1(7-37) significa que el fragmento en cuestión comprende los residuos aminoácidos número 7 (incluido) al número 37 (incluido), contando desde el extremo N-terminal del péptido de partida, GLP-1. La secuencia de aminoácidos de la amida de GLP-1(7-36) y del GLP-1 (7-37) se indica en la fórmula I (SEQ ID NO: 25):

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-ValLys-Gly-Arg-X (I)

que reperesenta la amida de GLP-1(7-36) si X es NH2 y GLP-1 (7-37) si X es Gly-OH.

El GLP-1 es una hormona intestinal y es el agente insulinotrópico endógeno más potente, con efectos entre los que se incluye la estimulación de la actividad de la adenilato-ciclasa y la proteina-quinasa en las células beta. Fisiológicamente, junto con los polipéptidos inhibidores gástricos del intestino superior, hace las veces de una hormona incretina que reduce el nivel de glucemia. Por consiguiente, el GLP-1, secretado en respuesta a la ingesta de alimentos, tiene múltiples efectos por ejemplo en el estómago, el hígado, el páncreas y el cerebro, que obran conjuntamente para regular el azúcar en sangre. Por tanto, la amida del péptido similar al glucagón GLP-1(7-36) y su análogo no amidado GLP-1(7-37) han despertado un considerable interés debido a sus potentes efectos sobre el metabolismo de los carbohidratos y su aplicabilidad potencial al tratamiento de la diabetes, incluyendo la diabetes tipo 2. La diabetes tipo 2 se caracteriza por una resistencia a la insulina, esto es que las células no responden apropiadamente cuando hay insulina presente. Este es un problema más complicado que la diabetes tipo 1. La diabetes tipo 2 puede pasar inadvertida durante años en un paciente antes del diagnóstico, dado que los síntomas son generalmente más leves (sin cetoacidosis) y pueden ser esporádicos. No obstante, una diabetes tipo 2 inadvertida puede tener como resultado complicaciones graves, incluyendo insuficiencia renal y enfermedad cardíaca coronaria. Esto lleva a una mayor morbilidad y mortalidad.

Sin embargo, la amida de GLP-1 (7-36), o el GLP-1(7-37), tiene una vida corta en suero. El péptido es escindido por la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV) entre los residuos 8 y 9, de lo que resulta un péptido inactivo. Así, el GLP-1, administrado de forma exógena tiene una vida sumamente corta en el paciente tratado y, por tanto, no ejerce sus efectos fisiológicos en aplicaciones terapéuticas.

Se han llevado a cabo diversos intentos para sintetizar análogos estabilizados (contra DPP-IV) de GLP-1 (GLP-1(7-37)) presentes en la naturaleza. En particular se sustituyó el residuo 8, que in vivo es Ala, por otro residuo, por ejemplo Gly, Ser o Thr (Burcelin, R. y col. (1999), Metabolism 48, 252-258). El Gly8 y el análogo de G8 se han ensayado exhaustivamente, ambos como moléculas sintetizadas, y se han producido mediante líneas celulares diseñadas genéticamente para secretar el polipéptido mutante (Burcelin, R., y col. (1999), Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277-285). En el GLP-1 (7-37) se han introducido otras diversas modificaciones para mejorar su estabilidad in vivo sin comprometer su actividad biológica. Sin embargo, ninguno de estos planteamientos ha llegado a tener significación terapéutica alguna debido a los considerables problemas implicados.

Además, ninguno de estos planteamientos permite un suministro de larga duración de GLP-1 in vivo. Esto es debido a la degradación proteolítica arriba mencionada, al metabolismo del GLP-1 y a la degradación normal de proteínas que se produce en el cuerpo en general. Así, el paciente necesitado de GLP-1 debe recibir una o incluso múltiples dosis de GLP-1, o sus análogos o variantes, a intervalos cortos durante un largo período de tiempo o, incluso peor, durante toda la vida o, de cualquier modo, mientras padezca la enfermedad a tratar. Por consiguiente, un doctor en medicina o bien el propio paciente debe administrar dosis de GLP-1. Con el fin de evitar este problema, el GLP-1 puede administrarse proporcionando a un paciente células que contengan un ácido nucleico que codifique y exprese GLP-1. El implante de tales células aseguraría un suministro a más largo plazo de GLP-1 in vivo y, gracias a la secreción de GLP-1 desde las células injertadas, proporcionar GLP-1 directamente en el lugar de interés.

El documento WO 99/53064 da a conocer por ejemplo una estrategia para crear un casete de expresión de GLP-1 multimérico que puede incorporarse a diversos tipos de células, que son líneas celulares inmortalizadas públicas disponibles, y dividir los cultivos celulares primarios. Entre los ejemplos se incluyen neuroesferas sensibles al EGF, células madre progenitoras neurales sensibles al bFGF del SNC de mamíferos, aunque el ejemplo puesto en práctica utiliza células renales de cría de hámster (BHK). Se decía que las células transfectadas implantadas se habían utilizado para tratar con éxito a ratones diabéticos, permitiendo un control de la glucosa sustancialmente equivalente a los controles no diabéticos. Sin embargo, este tipo de técnica de implante no cumple los requisitos de un tratamiento rutinario para, por ejemplo, pacientes diabéticos.

Además, es conocido en el estado de la técnica actual que, por regla general, el sistema inmunitario reconoce las células extrañas y provoca una respuesta inmunitaria con el fin de proteger al organismo contra el material externo, por ejemplo células extrañas. El implante de células capaces de expresar GLP-1 o cualquiera de sus variantes o derivados puede llevar así a una respuesta inmunitaria en el organismo. Tal respuesta defensiva puede causar efectos colaterales considerables y no deseables durante el tratamiento y llevar a complicaciones graves o incluso a la muerte del organismo tratado.

Para resumir, actualmente no se dispone en la técnica de ninguna terapia eficaz para la diabetes tipo 2 que permita reducir el nivel de glucemia en base al GLP-1 durante un período de tiempo duradero.... [Seguir leyendo]

1. Microcápsula esférica que comprende como mínimo un revestimiento superficial y un núcleo, en la que el como mínimo un revestimiento superficial comprende polímeros reticulados, donde el núcleo comprende polímeros reticulados y células transfectadas con y capaces de expresar y secretar un péptido de fusión que comprende GLP-1, o un fragmento o una variante del mismo, seleccionados de un péptido de fusión que comprende como componente (I) en el extremo N-terminal una secuencia de GLP-1(7-35, 7-36 ó 7-37),

o un fragmento funcional o una variante de la misma, y como componente (II) en el extremo C-terminal una secuencia peptídica de al menos 9 aminoácidos y donde el péptido de fusión, sus fragmentos o variantes conservan la actividad biológica del GLP-1 nativo.

2. Microcápsula esférica según la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero reticulado del núcleo y/o del como mínimo un revestimiento superficial comprende biopolímeros.

3. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polímero reticulado del núcleo y/o el como mínimo un revestimiento superficial comprende un alginato.

4. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el polímero reticulado del núcleo y/o el como mínimo un revestimiento superficial comprende un polímero químicamente idéntico en concentraciones idénticas o diferentes, pudiendo los polímeros tener además pesos moleculares diferentes y/o estar reticulados de maneras diferentes.

5. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el núcleo tiene un diámetro de aproximadamente 20 a aproximadamente 2.000 µm y en la que el como mínimo un revestimiento superficial tiene un espesor de aproximadamente 10 a aproximadamente 2.000 µm.

6. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la microcápsula comprende 1, 2, 3, 4, 5, 5-10 o más revestimientos superficiales.

7. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizada porque la microcápsula comprende un revestimiento superficial externo adicional consistente en policationes.

8. Microcápsula esférica según la reivindicación 7, caracterizada porque el revestimiento superficial externo adicional consiste en poli-L-lisina.

9. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizada porque el componente

(I) del péptido de fusión contiene una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 1.

10. Microcápsula esférica según la reivindicación 9, caracterizada porque el componente (II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia según la SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI) o una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 22.

11. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, caracterizada porque el componente

(II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia según la SEQ ID NO 23 (RRDFPEEVAIVEEL) o la SEQ ID NO 24 (RRDFPEEVAIAEEL) o una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 23 ó 24.

12. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque el componente

(II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia según la SEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG)

o la SEQ ID NO 3 (RRDFPEEVAIAEELG) o una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 2 ó 3.

13. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizada porque el componente

(I) y el componente (II) están ligados directamente o a través de una secuencia conectora.

14. Microcápsula esférica según la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia conectora tiene una longitud de 1 a 10 aminoácidos.

15. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizada porque el péptido de fusión contiene una secuencia según la SEQ ID NO 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDF-PEEVAIAEELG) o la SEQ ID NO 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK-EFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG) o una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 8 ó 12.

16. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizada porque el péptido de fusión contiene, alternativa o adicionalmente al componente (II), un componente (III), pudiendo el componente (III) estar ligado al término C del componente (I) y/o al término N del componente (I), si los

componentes (I) y (III) están presentes en la proteína de fusión, o pudiendo el componente (III) estar ligado al término C del componente (II) y/o al término N del componente (I), si los componentes (I), (II) y (III) están presentes en la proteína de fusión.

17. Microcápsula esférica según la reivindicación 16, caracterizada porque el componente (III) comprende como mínimo cuatro residuos de aminoácidos, preferentemente como mínimo 10 residuos de aminoácidos adicionales y con mayor preferencia como mínimo 20 o como mínimo 30.

18. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizada porque el componente

(III) comprende como mínimo 4, preferentemente como mínimo 10 y con mayor preferencia como mínimo 20 residuos de aminoácido adicionales de la secuencia N-terminal de GLP-2 como en el proglucagón o de GLP-1 (7-37).

19. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque el componente (III) contiene la secuencia de SEQ ID NOs 4 ó 5 o una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 4 ó 5.

20. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizada porque el péptido de fusión contiene una secuencia peptídica seleccionada de un grupo consistente en SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 y SEQ ID NO 26, o una secuencia que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs 6, 7, 10, 11 ó 26.

21. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, caracterizada porque el péptido de fusión comprende una proteína portadora, en particular transferrina o albúmina, como componente (IV).

22. Microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 caracterizada porque las células contenidas en el núcleo de la microcápsula esférica se seleccionan entre células madre mesenquimales humanas, células diferenciadas derivadas de células madre mesenquimales humanas, incluyendo osteoblastos, condrocitos, células grasas (adipocitos) o células de tipo neurona, incluyendo células cerebrales.

23. Microcápsula esférica según la reivindicación 22, caracterizada porque las células contenidas en el núcleo de la microcápsula esférica están seleccionadas (in vitro) entre células madre mesenquimales humanas, diferenciándose las células in vitro o in vivo en células grasas (adipocitos) adecuadas para el trasplante en tejido adiposo.

24. Composición farmacéutica que comprende una microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. Procedimiento para producir una microcápsula esférica tal y como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende como mínimo un revestimiento superficial y un núcleo y en la que el como mínimo un revestimiento superficial comprende un polímero reticulado y el núcleo comprende un polímero reticulado y células biológicas capaces de expresar y secretar GLP-1, un fragmento o una variante del mismo, o un péptido de fusión que comprende GLP-1, o un fragmento o una variante del mismo, comprendiendo el procedimiento los pasos siguientes:

(a) preparar un núcleo que comprende un polímero reticulado y células biológicas capaces de expresar y secretar GLP-1, un fragmento o una variante del mismo, o un péptido de fusión que comprende GLP-1, o un fragmento o una variante del mismo;

(b) preparar como mínimo un revestimiento superficial que comprende un polímero reticulado.

26. Utilización de la microcápsula esférica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo I o tipo II, la resistencia a la insulina, trastornos de peso y enfermedades o estados asociados(as) a los mismos, incluyendo los trastornos de peso o estados asociados la obesidad, estados asociados al sobrepeso, desregulación de la saciedad, niveles reducidos de insulina plasmática, niveles elevados de glucemia o masa de células beta pancreáticas reducida,

o

para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y enfermedades o estados asociados(as) a los mismos, estando los trastornos neurodegenerativos y las enfermedades o los estados asociados(as) a los mismos seleccionados del grupo compuesto por la enfermedad de Alzheimer (EA) y otros estados neurodegenerativos centrales y periféricos seleccionados entre esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, ataxia telangiectasia, enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis múltiple, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Pick, ataxia espinocerebelosa, enfermedad de Schilder y enfermedad de Parkinson, o apoplejía,