Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a la peptidasa aumentada.

Un péptido de fusión que comprende, como componente (I), una secuencia N-terminal según:

**Fórmula**

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

en la que Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desaminohistidina, 2-aminohistidina, 3-hidroxihistidina, homohistidina, N-acetilhistidina, a-fluorometilhistidina, a-metilhistidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico, en el que Gly es particularmente preferido; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente; o **Fórmula**

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37.

Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a la peptidasa aumentada.

La presente invención se refiere nuevos péptidos de fusión de GLP-1, que tienen un C-terminal extendido, son resistentes a la inactivación por endopeptidasa IV, pueden expresarse a altos niveles en células animales transformadas, y son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de la diabetes de tipo 2.

El gen del glucagón está bien estudiado, véase, por ejemplo, White, J.W., et al., 1986, Nucleic Acid Res., 14 (12) :4719-4730. La molécula de preproglucagón, como molécula precursora de alto peso molecular, es sintetizada en células alfa pancreáticas y en las celulas L del yeyuno y del colon. El preproglucagón es una prohormona con una longitud de 180 aminoácidos y su secuencia contiene, además del glucagón, dos secuencias de estructura relacionada: el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) y el péptido 2 similar al glucagón (GLP-2) . En la molécula de preproglucagón, entre GLP-1 y GLP-2 existe una secuencia peptídica de 17 aminoácidos (o más bien una secuencia de 15 aminoácidos más el sitio de ruptura RR C-terminal) , el péptido intermedio 2 (IP-2) . La secuencia de IP-2 (localizada entre GLP-1 y -2 en la molécula precursora) normalmente se rompe de modo proteolítico después del aa 37 de GLP-1. Por tanto, el módulo de preproglucagón se rompe en varios péptidos, dependiendo de la célula y del entorno, que incluyen GLP-1 (1-37) , un péptido de 37 aminoácidos en su forma no procesada. En general, este procesamiento se produce en el páncreas y en el intestino. La secuencia de GLP-1 (1-37) después puede ser procesada de modo proteolítico para producir GLP-1 (7-37) activo, la forma procesada de 31 aminoácidos, o GLP1 (7-36) amida. Por consiguiente, la denominación GLP-1 (7-37) se refiere al fragmento en cuestión que comprende los restos aminoácidos desde el número 7 (inclusive) hasta el número 37 (inclusive) cuando se cuenta desde el extremo N-terminal del péptido de origen, GLP-1. La secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-36) amida y de GLP-1 (737) aparece en la fórmula I (SEQ ID NO:43) :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-ValLys-Gly-Arg-X (I) , que muestra GLP-1 (7-36) amida, en la que X es NH2, y GLP-1 (7-37) , en la que X es Gly-OH.

El GLP-1 es una hormona intestinal y es el agente insulinotrópico endógeno más potente con acciones que incluyen la estimulación de la actividad adenilato ciclasa y proteína quinasa en las células beta. Desde el punto de vista fisiológico, junto con el polipéptido inhibidor gástrico del intestino superior, actúa como hormona incretina que disminuye el nivel sanguíneo de glucosa. Por consiguiente, GLP-1, que se segrega en respuesta al consumo de alimentos, tiene múltiples efectos, por ejemplo, en el estómago, hígado, páncraes y cerebro, que actúan en concierto para regular el azúcar sanguíneo. Por consiguiente, el péptido similar al glucagón GLP-1 (7-36) amida, y su análogo no amidado GLP-1 (7-37) , han atraído un interés considerable debido a sus potentes acciones sobre el metabolismo de carbohidratos y su potencial aplicación al tratamiento de la diabetes, incluyendo la diabetes de tipo 2. La diabetes de tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina, puesto que las células no responden de forma apropiada cuando la insulina está presente. Este es un problema más complejo que la diabetes de tipo 1. La diabetes de tipo 2 puede pasar desapercibida durante años en un paciente antes del diagnóstico, puesto que los síntomas generalmente son más suaves (no hay cetoacidosis) y pueden ser esporádicos. Sin embargo, pueden producirse graves complicaciones como resultado de una diabetes de tipo 2 no detectada, incluyendo insuficiencia renal y enfermedad cardíaca coronaria. Esto conduce a una mayor morbilidad y mortalidad.

La GLP-1 (7-36) amida o el GLP-1 (7-37) tienen una corta vida en suero. La dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) rompe el péptido entre los restos 8 y 9. El péptido roto es inactivo. Por tanto, el GLP-1 administrado de modo exógeno tiene una vida extremadamente corta y tiene una utilidad limitada para aplicaciones terapéuticas.

Se han realizado diversos intentos para sintetizar análogos estabilizados (frente a DPP-IV) de GLP-1 natural (GLP1 (7-37) ) . En particular, el resto 8, que in vivo es Ala, ha sido reemplazado por otro resto, por ejemplo, Gly, Ser o Thr (Burcelin, R., et al. (1999) , Metabolism, 48, 252-258) . El análogo de Gly8 o G8 se ha ensayado a fondo, tanto como molécula sintetizada como producida por líneas celulares modificadas genéticamente para que segreguen el polipéptido mutante (Burcelin, R., et al. (1999) , Annals of the New York Academy of Sciences, 875:277-285) . Se han introducido diversas otras modificaciones en GLP-1 (7-37) para potenciar su estabilidad in vivo sin comprometer su actividad biológica. Sin embargo, todas estas estrategias no han logrado ninguna importancia terapéutica significativa debido a los considerables problemas implicados.

El documento WO 02/46227 describe proteínas de fusión de GLP-1 que comprenden compuestos similares al glucagón-1 condensados con proteínas adecuadas para extender la semivida in vivo de los péptidos. En particular, el documento WO 02/46227 describe una proteína de fusión de GLP-1 con albúmina o inmunoglobulina. Según el documento WO 02/46227, estas proteínas pueden utilizarse para tratar la diabetes mellitus no insulinodependiente, así como una diversidad de otros trastornos. Sin embargo, el documento WO 02/46227 no describe proteínas de fusión que comprenden, como componente (I) GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) en el N-terminal o cualquiera de sus derivados, y como componente (II) una secuencia peptídica que contiene una secuencia según SEQ ID NO:26 (AADFPEEVAI) en el C-terminal.

De forma similar, el docucmento US 2003/0221201 describe proteínas de fusión de transferrina y GLP-1. De manera similar, el documento US 2003/0195154 describe una proteína de fusión de GLP-1 y transtiretina como compañeros de fusión. Sin embargo, no se describen ni se sugieren otras proteínas de fusión de GLP-1 en los documentos US 2003/0221201 o US 2003/0195154, en particular ningún otro compañero de fusión posible para GLP-1 capaz de estabilizar a GLP-1 in vivo.

El documento 99/46283 describe un conjugado de péptido farmacológicamente activo que comprende una secuencia peptídica farmacológicamente activa (X) , como GLP-1, y una secuencia peptídica estabilizante (Z) de 4 a 20 restos aminoácidos, que está unida covalentemente a la secuencia peptídica farmacológicamente activa (X) . La secuencia peptídica estabilizante (Z) puede ser, por ejemplo, secuencias Lysp-Xaaq o Xaap-Lysq, en ls que p y q son números enteros en el intervalo de 1 a 14, con la condición de que p+q esté en el intervalo de 3-15, y cada Xaa se selecciona independientemente del grupo que consiste en Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Orn, ácido 2, 4diaminobutanoico, ácido 2, 3-diaminopropanoico y Met, en particular secuencias peptídicas cortas de fórmula Lys3-Glu3, o Glu3-Lys3. El documento WO 99/46283 no describe proteínas de fusión que comprenden, como componente (I) GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) en el N-terminal o cualquiera de sus derivados, y como componente (II) una secuencia peptídica que contiene una secuencia según SEQ ID NO:26 (AADFPEEVAI) en el C-terminal.

El documento WO 03/058203 describe un péptido de GLP-1 acoplado con un C-terminal extendido que proporciona mayor estabilidad. Este C-terminal extendido comprende al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de 7 a 9 aminoácidos. El documento WO 03/058203 no describe proteínas de fusión de GLP-1 que comprenden una secuencia según SEQ ID NO:26 (AADFPEEVAI) como C-terminal extendido.

El documento US 2004/0146985 describe una proteína de fusión de GLP-1 (7-37) que contiene múltiples copias del péptido de GLP-1 (7-37) para producir este agente terapéutico a gran escala. El documento US 2004/0146985 no describe una proteína de fusión de GLP-1 (7-37) que comprende, como componente (I) GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) en el N-terminal o cualquiera de sus derivados, y como componente (II) una secuencia peptídica que contiene una secuencia según SEQ ID NO:26 (AADFPEEVAI) en el C-terminal.

El documento US 5.861.284 describe péptidos de fusión de GLP-1 (7-37) y una secuencia de aminoácidos derivada del factor de crecimiento de fibroblastos en el C-terminal. La invención del documento US 5.861.284 se refiere en particular a la producción de péptidos sin cisteína, producidos mediante una proteína de fusión que comprende una proteína que tiene cisteína en su extremo N-terminal, y un péptido sin cisteína... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de fusión que comprende, como componente (I) , una secuencia N-terminal según:

(i) la fórmula II

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

en la que Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desaminohistidina, 2-aminohistidina, 3-hidroxihistidina, homohistidina, Nacetilhistidina, a-fluorometilhistidina, a-metilhistidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico o ácido (1aminociclooctil) carboxílico, en el que Gly es particularmente preferido; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente; o (ii) la fórmula III

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

en la que Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desaminohistidina, 2-aminohistidina, hidroxihistidina, homohistidina, Nacetilhistidina, a-fluorometilhistidina, a-metilhistidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico o ácido (1aminociclooctil) carboxílico; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa34 es Lys, Glu o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg o Lys, amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu o Lys, amida o está ausente; o (iii) GLP-1 (7-37) de SEQ ID NO:1 o una secuencia funcional que ejerce los efectos biológicos de GLP-1 como hormona incretina, su acción antiapoptótica o sus propiedades neutróficas y que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 80% con GLP-1 (7-37) ;

y como componente (II) una secuencia peptídica en el C-terminal de al menos 9 aminoácidos, y que contiene una secuencia según SEQ ID NO:26 (AADFPEEVAI) o una secuencia que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO:26, que otorga una mayor resistencia frente a la inactivación por DPP-IV del péptido de fusión; o un péptido de fusión que comprende los componente (I) y (II) según se definió anteriormente, en el que al menos uno de los aminoácidos está derivatizado mediante una modificación del esqueleto peptídico, en el que la modificación del esqueleto peptídico produce un mimético de andamiaje, cuyo esqueleto es diferente del esqueleto natural, y cuyas cadenas laterales son idénticas al péptido de fusión no modificado; o un péptido de fusión que comprende los componentes (I) y (II) según se definió anteriormente, en el que se proporciona un isómero retro-inverso del péptido de fusión.

2. El péptido de fusión según la reivindicación 1 que comprende, como componente (I) en el N-terminal, una secuencia GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) , y como componente (II) una secuencia peptídica en el C-terminal de al menos 9 aminoácidos, y que contiene una secuencia según SEQ ID NO:26 (AADFPEEVAI) , que otorga una mayor resistencia frente a la inactivación por DPP-IV del péptido de fusión.

3. Un péptido de fusión según la reivindicación 2, en el que el componente (I) contiene una secuencia que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 80% con SEQ ID NO:1.

4. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente (II) tiene un motivo de secuencia N-terminal seleccionado del grupo que consiste en XA o AX, en el que X es un aminoácido natural o un aminoácido no natural modificado.

5. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente (II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27 (AADFPEEVAIVEEL) y SEQ ID NO:28 (AADFPEEVAIAEEL) , o una secuencia que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 80% con cualquiera de SEQ ID NO:27 o 28.

6. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 5, en el que el componente (II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29 (AADFPEEVAIVEELG) y SEQ ID NO:30 (AADFPEEVAIAEELG) , o una secuencia que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 80% con cualquiera de SEQ ID NO:29 o 30.

7. Un péptido de fusión según la reivindicación 6, en el que el componente (II) es una secuencia peptídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30, o una secuencia que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 80% con SEQ ID NO:29 o 30.

8. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 7, en el que el componente (II) es una secuencia peptídica que de 9 a 30, preferiblemente de 9 a 20, y lo más preferiblemente de 9 a 15 aminoácidos.

9. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 8, en el que el componente (I) y el componente (II) están unidos directamente o están unidos a través de una secuencia conectora.

10. Un péptido de fusión según la reivindicación 9, en el que la secuencia conectora tiene una longitud de 1 a 10 aminoácidos.

11. Un péptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el péptido de fusión

contiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:31

(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG) y SEQ ID NO:38

(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG) .

12. Un péptido de fusión según la reivindicación 11, en el que el péptido de fusión consiste en la SEQ ID NO:31 o consiste en la SEQ ID NO:38.

13. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido de fusión contiene otro componente (III) unido al C-terminal del componente (II) y/o al N-terminal del componente (I) .

14. Un péptido de fusión según la reivindicación 13, en el que el componente (III) comprende al menos cuatro restos aminoácidos, preferiblemente al menos 10 restos aminoácidos adicionales, y lo más preferiblemente al menos 20, o al menos 30.

15. Un péptido de fusión según la reivindicación 13 o 14, en el que el componente (III) comprende al menos 4, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20 restos aminoácido adicionales de la secuencia Nterminal de GLP-2 como en el proglucagón o de GLP-1 (7-37) .

16. Un péptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el componente (III) contiene la secuencia de SEQ ID NO:4 o 5, o una secuencia que tiene una coincidencia de secuencia de al menos 80% con SEQ ID NO:4 o 5.

17. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 16, en el que al menos uno de los aminoácidos está derivatizado con una modificación covalente de una cadena laterla de un aminoácido natural, o con una modificación de los grupos NH2- o carboxi-terminales.

18. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 17, en el que al menos uno de los aminoácidos está derivatizado con un grupo lipilo o carbohidrato.

19. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 18, en el que el resto His Nterminal de GLP-1 (GLP-1 (7) ) está químicamente modificado en su NH2-terminal y/o en su cadena lateral de histidilo, en particular, con un resto hidrófobo.

20. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 19, en el que el péptido de fusión comprende una proteína transportadora, en particular transferrina o albúmina, como componente (IV) .

21. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 20, en el que la secuencia de aminoácidos de los componentes (I) , (II) y/o (III) está invertida, y en el que dicha secuencia o secuencias de aminoácidos están al menos parcialmente compuestas de isómeros de D-aminoácidos.

22. Un método para producir un péptido de fusión según cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 21, mediante una síntesis peptídica en fase sólida.

23. Un ácido nucleico que codifica un péptido de fusión según cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 16 o 20.

24. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 23.

25. Una célula hospedante que comprende ADN introducido de modo exógeno según la reivindicación 23, en particular un vector según la reivindicación 24, que es capaz de expresar dicho péptido de fusión, en la que dichas células no comprenden células precursoras embrionarias humanas.

26. Un método para producir un péptido de fusión según cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 16 o 20, en el que se fermentan células microbianas o animales transformadas para incluir un ácido nucleico que codifica el péptido de fusión, y se recupera el péptido de fusión.

27. El método para producir un péptido de fusión según la reivindicación 26, en el que las células microbianas o 5 animales se cultivan bajo condiciones en las que el péptido de fusión es exportado desde las células.

28. Una formulación que contiene el péptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que el péptido de fusión se formula en forma neutra o salina, en particular como la sal acetato.

29. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 21, como un medicamento para su uso en terapia humana o animal.

30. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 21, un ácido nucleico según la reivindicación 23, un vector según la reivindicación 24, una célula hospedante según la reivindicación 25, o una formulación según la reivindicación 28, para su uso para el tratamiento de la diabetes melitus de tipo I o de tipo II, la resistencia a la insulina, enfermedades y trastornos del peso o afecciones relacionadas con estos.

31. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 21, un ácido nucleico según la reivindicación 23, un vector según la reivindicación 24, una célula hospedante según la reivindicación 25, o una formulación según la reivindicación 28, para su uso para el tratamiento de enfermedades y trastornos neurodegenerativos o afecciones relacionadas con estos.

32. Un péptido de fusión según una cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a 21, un ácido nucleico según la reivindicación 23, un vector según la reivindicación 24, una célula hospedante según la reivindicación 25, o una formulación según la reivindicación 28, para su uso para el tratamiento de enfermedades y trastornos o afecciones relacionadas con la apoptosis.