MÉTODOS PARA PREVENIR LA GLUCONOILACIÓN DE PROTEÍNAS.

Un método para prevenir la gluconoilación de polipéptidos expresados en una cepa B de E.

coli, que comprende introducir DNA en la E.coli, donde el DNA codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 95% respecto al SEQ ID NO:8.

Metodos para prevenir la gluconoilacion de proteinas CAMPO DE LA INVENCION

Esta invencion esta en el campo de la ingenieria bioquimica. Mas particularmente, esta invencion se refiere a procedimientos de fermentacion para producir polipeptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Escherichia coli (" E. coli") es un hospedante usado habitualmente para expresar proteinas para propositos de investigacion, diagnostico, terapeuticos e industriales. Los sistemas de expresion modernos pueden lograr altos niveles de una amplia variedad de proteinas (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology 10:411-421 (1999) ) . Sin embargo, la calidad de la proteina expresada con frecuencia es tan importante o mas importante que la cantidad. Las proteinas expresadas en E. coli se pueden formar como agregados insolubles, o pueden tener aminoacidos mal incorporados (Bogosian, et al., Journal of Biological Chemistr y 264:531-539 (1989) ) , o retener la metionina N-terminal (Chaudhuri, et al., Journal of Molecular Biology 285:1179-1194 (1999) ; Vassileva-Atanassova, et al., Journal of Biotechnology 69:6367 (1999) ; Yamashita, et al., Protein Expression & Purification 16:47 -52 (1999) ) . Ademas, se pueden producir modificaciones postraduccionales indeseadas tales como oxidacion (Berti, et al, Protein Expression & Purification 11:111-118 (1997) ; Konz, et al., Biotechnology Progress 14:393-409 (1998) ) o α-N-6-fosfogluconoilacion (Geoghegan, et al., Anal. Biochem. 267:169-184 (1999) ; Kim et al., Acta Cr y stallographica Section D-Biological Cr y stallography 57:759-762 (2001) ; Yan, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 262:793-800 (1999) "Yan et al. I"; Yan, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 259:271-282 (1999) "Yan et al. II") . Estas modificaciones pueden afectar adversamente a la actividad, estabilidad, estructura o inmunogenicidad de la proteina expresada, reduciendo en gran medida la utilidad de E. coli como hospedante para expresar polipeptidos.

Se ha descrito la alfa (α) -N-6-fosfogluconoilacion de varias proteinas recombinantes fusionadas con marcadores de afinidad de hexahistidina ("marcadores hexa-His") (Geoghegan, et al.; Kim, et al.; Yan et al. I; Yan et al. II) . En estos estudios, se encontro que un derivado de acido gluconico se unia al extremo de la proteina recombinante. Todas estas proteinas se expresaron en cepas B de E. coli, usando vectores basados en pET (Novagen) . Donde se indicaba, se uso medio LB. El aducto se detecto como una masa adicional asociada con el polipeptido de 258 Daltons ("Da") , que representaba la adicion de la 6-fosfogluconolactona (6-PGL) , o de 178 Da, que representaba la presencia de gluconolactona sin el fosfato. Se supuso que la fosfogluconoilacion se producia en el grupo α-amino N-terminal por reaccion con la 6-PGL endogena, un producto intermedio del ciclo de las pentosas fosfato. Se propuso que el aducto de +178 Da era el resultado de la actividad enzimatica actuando en el aducto de +258 Da para eliminar el fosfato. Se mostro que la formacion del aducto era especifica para la secuencia de aminoacidos en el extremo N adyacente al marcador de His. Las secuencias polipeptidicas GXXHHHH, donde XX es SS, SA, AS, o AA, eran las mas propensas a la α-N-6-fosfogluconoilacion, mientras que SHHHHHH era menos propensa, y PHHHHHH y PFHHHHHH no se modificaban en absoluto (Geoghegan, et al.) . No se detectaron modificaciones de otros grupos amino en ninguna otra parte de la proteina en experimentos in vivo o in vitro que usaron niveles altos de gluconolactona anadida. (Geoghegan, et al.)

Se ha mostrado que la fosfogluconoilacion N-terminal inhibe la cristalizacion de proteinas (Kim, et al.) , pero se sabe relativamente poco mas sobre su efecto en la funcion, estabilidad o inmunogenicidad de la proteina. Se espera que la 6-PGL, que es un potente electrofilo, pueda estar implicada en reacciones de glicacion in vivo (Rakitzis and Papandreou, Chemico-Biological lnteractions 113:205-216 (1998) ) . La glicacion de proteinas se ha estudiado ampliamente y se sabe que juega un papel fundamental en el envejecimiento y estados patologicos relacionados con complicaciones diabeticas (Baynes and Monnier, The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition. Alan R. Liss, New York (1989) ) . Se ha mostrado que la delta-gluconolactona anadida de forma exogena, produce glicacion de la hemoglobina, que puede ser un factor en las complicaciones vasculares de la diabetes (Lindsay, et al., Clinica Chimica Acta 263:239247 (1997) ) . Ademas, la glicacion de la alanina-aminotransferasa en el grupo epsilon-amino de la Lys 313 reduce notablemente su actividad catalitica (Beranek, et al., Molecular & Cellular Biochemistr y 218:35-39 (2001) ) .

Se ha mostrado que la 6-fosfogluconolactonasa ("pgl") es una enzima esencial de la ruta de las pentosas fosfato, especificamente en la hidrolisis de PGL a acido 6-fosfogluconico. (Miclet, et al., J. Biol. Chem. 276:34840-34846 (2001) ) . Se ha identificado el gen que codifica esta enzima en seres humanos (Collard, et al., FEBS Letters 459:223226 (1999) ) , Pseudomonas aeruginosa (Hager, et al., Journal of Bacteriology 182:3934-3941 (2000) ) , y Tr y panosoma brucei y Plasmodium falciparum (Miclet, et al.) . Aunque se ha observado la actividad de la pgl desde hace tiempo en E. coli (Kupor and Fraenkel, Journal of Bacteriology 100:1296-1301 (1969) "Kupor I" and Kupor and Fraenkel, Journal of Biological Chemistr y 247:1904-1910 (1972) "Kupor II") , no se ha identificado la secuencia genica responsable de la codificacion de una enzima con esta actividad (Cordwell, S. J. Arch. Microbiol. 172:269-279 (1999) ) . Se ha sugerido que ademas de permitir el flujo metabolico por el ciclo de las pentosas fosfato, la actividad de la pgl dentro de la celula previene la acumulacion de 6-PGL y las consiguientes reacciones perjudiciales con nucleofilos intracelulares (Miclet, et al.) . Las observaciones descritas de fosfogluconoilacion de proteinas en el extremo N, apoyan la hipotesis de que la 6-PGL producida en la ruta puede modificar proteinas, pero no se han descrito pruebas de que la modulacion de la actividad de la pgl pueda afectar a los niveles de proteina modificada.

Ademas, la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) es un hospedante usado habitualmente para expresar proteinas con propositos de investigacion, diagnostico, terapeuticos e industriales, Studier, F.W., and Moffatt, B.A., J. Mol. Biol. 1986 May 5; 189 (1) :113-130. Esta cepa es comercialmente atractiva porque alcanza niveles muy altos de expresion de proteina recombinante mediante acoplamiento de la expresion de una copia cromosomica de la RNA-polimerasa de T7 y el uso de un promotor de RNA-polimerasa de T7 basado en plasmido en la proteina recombinante de interes. De acuerdo con esto, puesto que la RNA-polimerasa de T7 es una RNA-polimerasa extremadamente selectiva y activa, la transcripcion de la proteina recombinante se acumula con niveles muy altos, con frecuencia incluso hasta el punto de que disminuyen los transcritos de la celula hospedante.

Desafortunadamente, la cepa BL21 (DE3) libera muy lentamente, aunque detectable, particulas de fago lambda infeccioso, del orden de 10-20 unidades formadoras de placa/ml (UFP) , Stewart Shuman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 89:3489-3493. Segun parece, se introdujo el gen de la RNA-polimerasa de T7 en el cromosoma de la celula hospedante BL21 mediante transduccion con el fago lambda defectuoso DE3 que llevaba el gen de la RNA-polimerasa de T7 insertado en el gen int de lambda, Studier, F.W., and Moffatt, B.A., J. Mol. Biol. 1986; 189 (1) :113-130. El profago defectuoso resultante no puede replicarse normalmente debido a la interrupcion del gen int. La escision cromosomica del profago DE3 es un requisito para la replicacion del profago antes del empaquetamiento y liberacion de particulas de fago infeccioso, y depende de la recombinacion de la escision homologa que es dirigida por el producto del gen int. Como se describe en la presente memoria, niveles muy bajos de particulas de fago liberadas son debidos a sucesos de escision del profago aleatorios independientes de int. Aunque la liberacion de niveles muy bajos de particulas de fago infeccioso puede ser aceptable en algunos laboratorios de investigacion, cualquier liberacion de fago infeccioso es totalmente inaceptable en el marco de instalaciones de fabricacion biofarmaceuticas, tanto debido a consideraciones de seguridad para el paciente como a que la liberacion de agentes infecciosos puede poner en riesgo otros procedimientos de fabricacion basados en... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para prevenir la gluconoilacion de polipeptidos expresados en una cepa B de E.coli, que comprende introducir DNA en la E.coli, donde el DNA codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de al menos 95% respecto al SEQ ID NO:8.

5 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que dichos polipeptidos comprenden una interleuquina humana.

3. Un metodo para producir una interleuquina humana que comprende expresar conjuntamente dicha interleuquina humana en una cepa B de E.coli con un DNA que codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:8.

4. Un metodo segun la reivindicacion 2 o reivindicacion 3, en el que la interleuquina humana es IL-18.

10 5. Un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el DNA que codifica la enzima 6fosfogluconolactonasa tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con respecto a SEQ ID NO:7.

6. Un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el DNA que codifica la enzima 6fosfogluconolactonasa comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO:7.

7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el DNA se transforma en el DNA genomico 15 de la E.coli.

8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa B de E.coli es BL21.

9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipeptido es un polipeptido expresado heterologamente.

Figura 1

Figura 2 Figura 3

Figura 4 Figura 5

Figura 6 Figura 7

Figura 8