Un método ex vivo de diagnóstico del cáncer o una lesión pre-maligna,

el método que comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de un CD24 en circulación, que no está unido a las células intactas en una muestra biológica del sujeto que lo necesite, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de materia fecal, una muestra de orina y una muestra de saliva, en donde dicha presencia y/o dicho nivel del citado CD24 en circulación, por encima de un umbral predeterminado, es indicativo del cáncer o de la lesión pre-maligna

CAMPO .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con los métodos para la detección precoz, no-invasiva del cáncer utilizando CD24, y más particularmente, con los métodos para diagnosticar cáncer o lesiones pre-malignas mediante la 5 determinación del nivel de expresión de CD24 soluble, descamado y/o vesiculado, en una muestra biológica.

El cáncer colorectal (CRC) es, un principal problema de la salud en el mundo Occidental, ya que es el tercer cáncer más común en tanto los hombres como las mujeres en los Estados Unidos e Israel. Esta forma del cáncer se desarrolla a través de un proceso gradual que involucra una variedad de cambios genéticos y epigenéticos que son adquiridos a lo largo de muchos años y eventualmente culminan en la transformación del epitelio normal en neoplasma. 10 Aunque la enfermedad tiene un largo periodo de latencia, los marcadores disponibles en la actualidad para la detección de la enfermedad se limitan a pruebas invasivas tales como endoscopia gástrica o de colon, que generalmente detectan la enfermedad, mientras que ya se ha diseminado.

Las mutaciones en oncogenes y genes supresores del tumor, expresión del gen anormal y defectos genéticos en una variedad de genes, se involucran íntimamente en la carcinogénesis del CRC. Sobre la base de los alelotipos de 15 una serie de tumores de colon, Vogelstein y sus colegas han mostrado que las etapas moleculares que ocurren después de la activación de la senda APC- β-catenina - Tfc involucran una acumulación no-lineal de cambios genéticos específicos que acompañan la transición de la mucosa colónica normal a carcinoma metastásico. Estos incluyen mutaciones en el oncogén k-Ras, los cambios en patrones de metilación, pérdida de DCC (Suprimido en gen del Cáncer Colorectal) y SMADs [homólogos de la proteína de drosófila Madres en contra de la Decapentaplejia (MAD), y la 20 proteína C. elegans SMA] y mutaciones en p53.

Los métodos de detección disponibles en la actualidad para cánceres del tracto gastrointestinal (tracto GI) tales como cáncer colorectal (CRC), incluyen la prueba de sangre oculta en materia fecal (FOBT). Sin embargo, aunque las pruebas clínicas han mostrado que la detección con FOBT en serie reduce la mortalidad de CRC (Mandel J, et al., 1993,), la sensibilidad de FOBT se limita [60%; McMahon PM, et al., 2001]. Varios marcadores se han sugerido 25 recientemente como herramientas de diagnóstico no-invasivas. Estas proteínas incluyen [por ejemplo, calprotectina fecal, lactoferrina, lisozima, albúmina, alfa-1-antitripsina, antígeno carcinoembrionario (CEA), factor de aceleración del decaimiento (DAF), proteína de mantenimiento minicrosomal (MCM2)] o ARNm (por ejemplo, COX-2 fecal) (Kanaoka S., et al., 2004) que se puede detectar en muestras de materia fecal, y proteínas tales como nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT) (Roessler M, et al., 2005) o subunidad 3 del complejo activador del proteasoma (PSME3) 30 (Roessler M., et al., 2006), que se puede detectar en muestras de suero. Sin embargo, debido a su baja sensibilidad y especificidad, estos marcadores no están en uso clínico.

CD24, también conocido como antígeno estable al calor (HSA) en ratones, es una proteína de la superficie celular, similar a la mucina anclada al fosfatidilinositol altamente glicosilada. Fisiológicamente, la proteína CD24, se expresa principalmente sobre subpoblaciones hematopoyéticas de los linfocitos B, varias células epiteliales, células 35 musculares y neurales. Juega un papel crucial en la selección y maduración celular durante la hematopoyésis y se expresa durante el periodo embrionario, en el desarrollo de las células neurales y pancreáticas. Además, CD24 es un ligando potencial para P-selectina que funciona como una molécula de adhesión que aumenta la agregación de las plaquetas.

La función celular de CD24 aún se desconoce, pero recientes reportes han reforzado su participación en la 40 iniciación de transducción de la señal intracelular. Schabath et al. (Schabath H, et al., 2006) han asociado la expresión de CD24 con la regulación hacia abajo, en el receptor de la quimioquina CXCR-4. Además, CD24 se sobre expresa en varios tejidos malignos incluyendo los linfomas de célula-B, carcinoma de gliomas, de pulmón de célula pequeña y no pequeña, hepatocelular, de célula renal, nasofaríngeo, de vejiga, uterino, de ovario epitelial, de mama, de próstata y pancreático (revisado por Kristiansen et al., 2004). Por otra parte, se encontró que su expresión se correlaciona con el 45 aumento de la velocidad de crecimiento, motilidad y supervivencia en líneas de células de carcinoma derivadas de varios órganos (Baumann P, et al., 2005; Smith SC, et al., 2006) y con un curso más agresivo del cáncer. De esta manera, Weichert W., et al. (2005), encontró que el aumento de la expresión de CD24 en el citoplasma, se correlaciona con un tumor de estadio más avanzado, grado y presencia de metástasis y se concluye que la sobre expresión de CD24 en el citoplasma (como resultado de la sobre producción o trastornos en la distribución en la célula) es un marcador de 50 pronóstico pobre. Además, el papel de CD24 en la agregación plaquetaria puede explicar la participación con la metástasis del cáncer y peor pronóstico (Sammar, M., et al., 1994; Aigner, S., et al., 1997; Aigner, S., et al., 1998).

U.S. Pat. Appl. 20040005596 para Li J., et al., revela los métodos de diagnóstico del cáncer, mediante la determinación del nivel de CD24 in situ, en muestras de tejido sospechoso de ser pre-canceroso o canceroso, necesitando así, otra vez procedimientos invasivos para la detección del cáncer. 55

Por lo tanto, existe, una necesidad ampliamente reconocida, y sería altamente ventajoso, tener un método de diagnóstico del cáncer, especialmente en el estadio pre-maligno, desprovisto de las limitaciones anteriores.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se describe mediante las reivindicaciones 1-6.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es CD24 - análisis de inmunoprecipitación (IP) de las líneas celulares de CRC. Los extractos de las líneas celulares de CRC HCT116 (que no expresan CD24) o HT29 (que expresa CD24) fueron sometidos a CD24-IP 5 seguido por análisis de Western blot, utilizando el anticuerpo de CD24 SWA11. Carril 1: Lisado total de células de CRC HCT116 (sin IP); carril 2: lisado total de las células de CRC HT29 (sin IP); carriles 3-8 - productos de elución de células HCT116 (carriles 3-5) o células HT29 (carriles 6-8) utilizando perlas de Sefarosa conjugadas anti-ratón (Sigma): en la ausencia del anticuerpo IP (primer fijador) (carriles 3 y 6), o después de IP utilizando el ML5 Ab (carriles 4 y 7) o el SWA11 Ab (carriles 5 y 8). 10

Tener en cuenta la IP eficiente utilizando el SWA11 Ab para CD24 (carril 8), demostrando que SWA11 es un apropiado anticuerpo IP, produciendo un fondo bajo.

Las FIGs. 2a-c son análisis de Western blot de CD24, de muestras de materia fecal obtenidas a partir de pacientes de CRC antes y después de la eliminación quirúrgica del tumor, o antes y después del tratamiento con quimioterapia. Los extractos de proteínas (cantidades iguales) a partir de muestras de materia fecal de 12 pacientes 15 (designadas P-1, P-2, P-3...P-12) diagnosticados con tumores colorectales [adenomas o adenocarcinomas (CRC)] fueron sometidos a análisis de Western blot utilizando el SWA11 Ab. Las manifestaciones clínicas de los pacientes antes de la eliminación quirúrgica son de la siguiente manera: paciente 1 (P-1) – pólipo de 15 mm; paciente 2 (P-2) - pólipo masivo; paciente 3 (P-3)- pólipo de 20 mm; paciente 4 (P-4) - pólipo de 5 mm, displasia de bajo grado; paciente 5 (P-5) - adenocarcinoma; paciente 7 (P-7) -adenocarcinoma; paciente 8 (P-8) - adenocarcinoma; paciente 9 (P-9) - pólipo 20 de 15 mm; paciente 10 (P-10) - pólipo de alto grado; paciente 11 (P-11) - adenocarcinoma; paciente 12 (P-12) - adenocarcinoma; paciente 6 (P-6) carcinoma del recto –sus muestras fueron tomadas tanto después de la eliminación del tumor como antes (carril 13) o después de (carril 14) la terapia de radiación. Figura 2a – carriles 1-9: Carril 1 - células HT29 (control positivo); carriles 2-3 - P-1; carriles 4-5 - P-2; carriles 6-7 - P-3; carriles 8-9 - P-4; Figura 2b - carriles 10-18: carril 10 - células HT29; carriles 11-12 - P-5; carriles 13-14 - P-6; carriles 15-16 - P-7; carriles 17-18 - P-8; 25 Figura 2c - carriles 19-27: carril 19 - células HT29; carriles 20-21 - P-9; carriles 22-23 - P-10; carriles...

1. Un método ex vivo de diagnóstico del cáncer o una lesión pre-maligna, el método que comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de un CD24 en circulación, que no está unido a las células intactas en una muestra biológica del sujeto que lo necesite, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de materia fecal, una muestra de orina y una muestra de 5 saliva, en donde dicha presencia y/o dicho nivel del citado CD24 en circulación, por encima de un umbral predeterminado, es indicativo del cáncer o de la lesión pre-maligna.

2. Un método ex vivo del seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer, que comprende la determinación de un nivel de un CD24 en circulación, que no está unido a las células intactas en una muestra biológica de un sujeto que sigue la terapia contra el cáncer, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que 10 consiste de una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de materia fecal, una muestra de orina y una muestra de saliva, en donde la terapia contra el cáncer se selecciona del grupo que consiste de terapia de radiación, quimioterapia y terapia de anticuerpos, en donde una disminución de un umbral predeterminado en dicho nivel del citado CD24 en circulación, después de la terapia contra el cáncer, es indicativo de una reducción de las células cancerosas, por lo tanto el seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer. 15

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho CD24 en circulación, es una especie de bajo peso molecular de CD24 entre 25 a 37 kDa,

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha lesión pre-maligna se selecciona del grupo que consiste de un adenoma, un pólipo adenomatoso, un esófago de Barrett, una neoplasia intraductal papilar mucinus (IPMN), un carcinoma ductal in situ (DCIS) en un seno, una leucoplasia y una eritroplasia. 20

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho CD24 en circulación se selecciona del grupo que consiste de CD24 descamado, CD24 vesiculado y CD24 soluble.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la lesión pre-maligna o el cáncer se asocia con un cáncer de tracto gastrointestinal.