PREDICCIÓN DE LA EVOLUCIÓN DEL CÁNCER.
Método para predecir la recidiva de cáncer en un sujeto tratado para una enfermedad cancerosa que comprende las etapas de:
- poner en contacto un ligando de afinidad por la proteína timidina cinasa 1 (TK1) con una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, dicho ligando se une específicamente a dicha proteína TK1; - determinar una cantidad de ligando que se une a dicha proteína TK1 y/o a un complejo que comprende la proteína TK1 en dicha muestra; y - estimar una probabilidad de futura recidiva de cáncer después de al menos un año tras el tratamiento contra el cáncer basándose en dicha cantidad determinada de unión de ligando y sin determinación de un nivel de actividad enzimática de TK1
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/SE2004/000750.
Solicitante: AROCELL AB.
Nacionalidad solicitante: Suecia.
Dirección: EKEBYVÄGEN 10 A1 752 75 UPPSALA SUECIA.
Inventor/es: ERIKSSON, STAFFAN, SKOG,SVEN, TRIBUKAIT,BERNHARD, HE,QIMIN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 14 de Mayo de 2004.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/574V2
Clasificación PCT:
- C12Q1/48 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
- G01N33/574 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para el cáncer.
Clasificación antigua:
- G01N33/573 G01N 33/00 […] › para enzimas o isoenzimas.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.
Fragmento de la descripción:
Predicción de la evolución del cáncer.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a la monitorización y predicción de enfermedades cancerosas y en particular a la predicción temprana de la evolución y reaparición de enfermedades cancerosas.
Antecedentes
El cáncer es una causa principal de muerte en los seres humanos y el número de individuos afectados aumenta cada año. Aunque los diferentes métodos de tratamiento para el cáncer, por ejemplo quimioterapia, terapia endocrina, radioterapia y cirugía, han mejorado tremendamente en las últimas décadas, están lejos de ser perfectos, en particular para pacientes con estadios tardíos de cáncer. Por tanto, se ha invertido mucha investigación en la detección temprana de tumores en pacientes.
Un método usado para la detección del estadio tumoral y de tumor es la determinación de la proliferación celular en pacientes. Se ha usado la proporción de células que sintetizan ADN (células en fase S) en tumores como una medida de su tasa de proliferación. Las células que sintetizan ADN se han determinado anteriormente por medio de timidina marcada con radioactividad (autorradiografía). La incorporación de análogos de halógeno de timidina (BrdU) y anticuerpos frente a los mismos se han usado junto con mediciones de ADN citométricas de flujo cuantitativas. La desventaja del uso de timidina marcada de manera isotópica y BrdU es que sólo pueden medirse células vivas. Por tanto, estos métodos sólo se han usado en pacientes seleccionados y en un número limitado de estudios [Wilson, Acta Oncol., 30:903, 1991]. Además, la técnica de citometría de flujo no puede distinguir entre las células en proliferación y las que no están en proliferación. La determinación de células en fase S es incluso más complicada en tumores, puesto que las células tumorales cancerosas no se apartan, en su contenido en ADN, de las células benignas [Tribukait, World J. Urol., 5:108, 1987].
En lugar de medir la propia síntesis de ADN, se han usado marcadores relacionados con células en proliferación, por ejemplo, Ki-67 y PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación). Ki-67 se expresa en todos los estadios del ciclo celular excepto en G0 [Scholzen, J. Cellular Physiol., 182:311, 2000]. Pueden usarse anticuerpos frente a Ki-67 en tejidos frescos así como en tejidos incrustados en parafina y fijados en formalina. Dependiendo de la tasa de proliferación celular, el PCNA se expresa en todas las etapas del ciclo celular. El PCNA no es tan sensible para diversas técnicas de fijación como Ki-67 [Hall, Cell Tissue Kinet., 25:502, 1990]. Se han sometido a prueba anticuerpos frente a otros tipos de proteínas y enzimas implicadas en la síntesis de ADN (ADN polimerasa, ribonucleótido reductasa), pero con resultados satisfactorios limitados [Wilson, Acta Oncol., 30:903, 1991].
La timidina cinasa (TK), una enzima de la ruta de recuperación de pirimidina, cataliza la fosforilación de timidina para dar timidina monofosfato. La TK en células humanas aparece en dos formas, una proteína citoplásmica (TK1) y una mitocondrial (TK2), codificada por diferentes genes. Las TK1 y TK2 humanas se ubican en el cromosoma 17q23.2-q25.3 y 16q22-q23.1, respectivamente. Los transcritos de TK1 codifican para una proteína de 25,5 kDa con regiones altamente conservadas típicas de nucleósido cinasas. Sin embargo, aún no se han determinado las estructuras cristalinas de esta familia de enzimas. La expresión de TK1 se regula por el ciclo celular y la regulación de TK1 es compleja con niveles de ARNm que alcanzan su nivel máximo en células en proliferación. El corte y empalme y la traducción del ARNm de TK1 también varían en las células en diferentes fases de crecimiento. Principalmente, los niveles de TK1 se regulan mediante mecanismos postraduccionales, en particular mediante degradación diferencial debido a la expresión de proteasa altamente activa en células mitóticas. La región C-terminal de TK1 contiene una secuencia específica, KEN, que se ha mostrado recientemente que es la señal de la degradación mitótica de TK1 en la ruta mediada por complejo promotor de la anafase/ciclosoma Cdhl [Ke, Mol. Cell. Biol., 24: 514, 2004]. La TK2 no se regula por el ciclo celular y es la única enzima TK encontrada en células en reposo [Wintersberger, Biochem. Soc. Trans., 25:303, 1997; Sherley, J. Biol. Chem., 263:8350, 1988; He, Cell. Prolif., 24:3, 1991; Kauffman, Mol. Cell. Biol., 11:2538, 1991; Hengstschläger, J. Biol. Chem., 269:13836, 1994; Munch-Petersen, J. Biol. Chem., 266:9032, 1991].
La mayoría de los marcadores mencionados anteriormente se han usado para identificar células en proliferación en tejidos. Sin embargo, se ha determinado la actividad de la timidina cinasa en fracciones de citosol de tejidos como marcador de proliferación en cáncer de mama humano. En un estudio de 1.692 pacientes con cáncer de mama [Broet, J. Clin. Oncol., 19:2778, 2000], la alta actividad de TK1 en el citosol se correlacionaba con una supervivencia más corta así como un mal resultado del tratamiento endocrino (tamoxifeno) [Foekens, Cancer Res., 61:1421, 2001]. Además, también se ha usado la timidina cinasa como un marcador de proliferación celular en suero midiendo su actividad enzimática.
Debido al acoplamiento estrecho entre la actividad enzimática de TK sérica (STK) y la alta proliferación, se considera un marcador sensible y útil para la proliferación celular y por tanto para la detección de tumores malignos [He, Internal. J. Biol. Marker, 15: 139, 2000; Zou, Internal. J. Biol. Marker, 17:135, 2002; He, Biochimica Biophysica Acta, 1289:25, 1996; He, Europ. J. Cell Biol., 70:117, 1996; Wu, Anticancer Res., 6:4867, 2000; Mao, Cancer Inves. 20:922, 2002; Wang, Analysis Cell. Pathology, 23:11, 2001; Kuroiwa, J. Immuno. Methods, 253: 1, 2001]. Por tanto, se ha usado la actividad enzimática de STK como marcador tumoral en pacientes con diferentes tumores sanguíneos. Sin embargo, se ha encontrado que la actividad de STK no es un buen marcador en pacientes con tumores sólidos.
Más del 95% de la actividad enzimática de STK corresponde a TK1 mientras menos del 5% corresponde a TK2. La composición y las propiedades de STK aún no se entienden bien. Los resultados indican que STK es una forma polimérica de TK1, probablemente también en complejo con otras proteínas séricas y tiene un peso molecular total de aproximadamente 700 kDa [Karlström, Mol. Cell. Biochem, 92:23, 1990].
Usando el análogo de timidina 5-yodo-2'-desoxiuridina como sustrato, se estableció la actividad de STK como un marcador de proliferación serológica en 1984 [Gronowich, Br. J. Cancer, 47:487, 1983] y ahora está disponible como kit de RIA comercial para radioensayo con [125I] (Sangtec Medical AB, Estocolmo, Suecia, recientemente adquirido por DiaSorin Inc.). El ensayo de actividad de STK ha sido útil para la estimación de la propagación y el pronóstico tumorales en pacientes con leucemia aguda y leucemia crónica (CLL), linfoma de Hodgkin y de no Hodgkin, pero no en el caso de tumores sólidos [Gronowich, Int. J. Cancer, 15:5, 1984]. La actividad enzimática de STK en un paciente con CLL proporciona información de pronóstico útil con respecto a ambas respuestas a la terapia y duración de supervivencia. Aunque el método es relativamente eficaz, especialmente para enfermedades de leucemia y linfoma, el 5-yodo-2'-desoxiuridina no es un sustrato específico para la actividad de STK (TK1). Además, la [125I]-radio-yodo-desoxiuridina tiene una semivida corta (cuatro semanas), la actividad enzimática de STK es altamente sensible a cambios de temperatura y pH, y el radioensayo requiere equipo especializado (contador de centelleo γ), laboratorio de isótopos y personal altamente cualificado. Las desventajas de una técnica de radioensayo de este tipo han limitado probablemente el uso clínico de este ensayo.
Por tanto, se ha desarrollado recientemente un nuevo kit de actividad de STK basándose en anticuerpos frente al producto de la reacción de STK. También se han generado anticuerpos anti-TK1 durante las últimas décadas, principalmente anticuerpos policlonales para investigación básica y no para uso comercial. Recientemente, se han desarrollado anticuerpos mono y policlonales de ratón anti-TK1 para fines clínicos potenciales, es decir para cáncer de mama [Zhang, Cancer Detección Prev.,...
Reivindicaciones:
1. Método para predecir la recidiva de cáncer en un sujeto tratado para una enfermedad cancerosa que comprende las etapas de:
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:
3. Método según la reivindicación 2, que comprende además predecir una futura recidiva de cáncer si una razón de dicha segunda cantidad de unión de ligando y dicha primera cantidad de unión de ligando supera uno.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que dicha primera cantidad de unión de ligando se determina en dicho sujeto 21 días tras dicho tratamiento contra el cáncer.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha segunda cantidad de unión de ligando se determina en dicho sujeto en el plazo de uno a seis meses después de dicho tratamiento contra el cáncer.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha segunda cantidad de unión de ligando se determina en dicho sujeto aproximadamente 3 meses después de dicho tratamiento contra el cáncer.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además las etapas de:
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ligando es un anticuerpo que se une específicamente a la parte C-terminal de TK1.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ligando es un anticuerpo que se produce frente a una secuencia peptídica seleccionada de:
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha etapa de determinación de la unión de ligando comprende la etapa de medir dicha unión de ligando mediante un inmunoensayo de transferencia puntual con quimioluminiscencia mejorada (ECL).
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha enfermedad cancerosa es una enfermedad cancerosa de tumor sólido.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha probabilidad de futura recidiva de cáncer se estima basándose directamente en dicha cantidad determinada de unión de ligando.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho complejo que comprende la proteína TK1 es un complejo de dicha proteína TK1 y una proteína o polipéptido, tal como un inhibidor o activador de dicha proteína TK1.
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