Un método para producir nauplios de Artemia nadantes libres a partir de una cantidad de quistes de una o más especies de Artemia,

que incluyen quistes en diapausa, incubando los quistes en un medio de eclosión en condiciones que permiten al menos a una parte de los quistes eclosionar y liberar nauplios nadantes libres, caracterizado porque los quistes se ponen en contacto con al menos un compuesto que comprende al menos una estructura -C(OH)=C(OH)- para interrumpir la diapausa en al menos un número de dichos quistes en diapausa con el fin de permitirles producir nauplios nadantes libres, aumentando con ello el porcentaje de eclosión de los quistes incubados desde X% del número total de quistes completos cuando los quistes no se ponen en contacto con dicho compuesto hasta un porcentaje de eclosión mayor que X% cuando se ponen en contacto con dicho compuesto

La presente invención se refiere a un método para eclosionar nauplios de Artemia a partir de una cantidad de quistes de una o más especies de Artemia, que incluyen quistes en diapausa, incubando los quistes en un medio de eclosión en condiciones que permiten que al menos una parte de los quistes eclosione y libere nauplios nadantes libres en un periodo de incubación predeterminado, método en el que 5 los quistes se ponen en contacto con un compuesto para interrumpir la diapausa en al menos un número de dichos quistes en diapausa con el fin de permitirles producir nauplios nadantes libres en dicho periodo de incubación predeterminado, aumentando con ello el porcentaje de eclosión de los quistes incubados desde X% del número total de quistes completos cuando los quistes no se ponen en contacto con dicho compuesto hasta un porcentaje de eclosión mayor que X% cuando se ponen en contacto con dicho 10 compuesto.

Los nauplios de Artemia se usan normalmente como organismos alimenticios vivos en acuicultura, más en particular como alimento vivo para las primeras fases larvarias de pescado marino y camarón. Los nauplios de Artemia como alimento vivo no están comercializados como tales, sino como quistes de Artemia fuera de los cuales se pueden eclosionar los nauplios. Hay diferentes especies de 15 Artemia que pueden producir quistes, tales como Artemia franciscana, Artemia persimilis, Artemia urmiana, Artemia tunisian, Artemia tibetiana, Artemia sínica y Artemia parthogenetica.

En los embriones enquistados o quistes de Artemia se detiene el desarrollo embrionario del animal (o entra en diapausa) en la fase de gástrula. Liberados como tales por la hembra en el medio acuático, estos embriones latentes o en diapausa no se desarrollarán además en nauplios nadantes libres 20 cuando por otra parte se someten a condiciones ambientales que favorecen la eclosión. El desarrollo se recuperará solamente cuando los mecanismos que controlan la diapausa se desactivan por estímulos externos. En el ambiente natural se conocen el estrés por frío (hibernación) y la deshidratación. Los embriones así activados (o quiescentes) pueden recuperar el desarrollo cuando las condiciones de incubación lo permiten. 25

Los quistes en diapausa así como aquiescentes pueden sobrevivir durante largos periodos de deshidratación y anoxia, temperaturas y presión extremas. En el ambiente natural tal resistencia es una estrategia de supervivencia de la especies puesto que los quistes con frecuencia son temporalmente la única etapa viviente del animal en un biotopo dado. Fuera de su ambiente natural, cuando están suficientemente deshidratados y almacenados adecuadamente, es decir, en un ambiente seco, 30 preferiblemente a bajas temperaturas y lejos de la luz y del oxígeno, los quistes permanecen viables durante un periodo considerable de tiempo (varios años). Esta propiedad de almacenabilidad prolongada y consiguiente disponibilidad en el comercio normal todo el año, junto con el tiempo de incubación corto necesario para producir los nauplios nadantes libres hacen de ellos la fuente más conveniente, menos laboriosa, de alimento vivo para acuicultura (Van Stappen, 1996). 35

Los quistes de Artemia para posteriores aplicaciones en acuicultura se recogen de un ambiente natural. En tal producto en bruto cosechado están presentes quistes quiescentes y en diapausa en proporciones variables. El producto comercial seco listo para usar se obtiene tras la aplicación de una serie de procedimientos de procesamiento y acondicionamiento. En el procesamiento el producto en bruto se purifica (separación de desechos), se lava (separación de sal) y finalmente se seca. Las técnicas de 40 acondicionamiento estándar tratan típicamente de copiar las condiciones naturales de hibernación (almacenamiento en depósitos fríos) y/o desecación (secado con aire caliente como parte de los procedimientos de procesamiento) y principalmente dan por resultado la desactivación del mecanismo de diapausa virtualmente en todos los quistes individuales.

Sin embargo, muchas veces la capacidad para eclosionar de los quistes tratados permanece 45 mala puesto que los embriones no son capaces de continuar hacia la fase de los nauplios nadantes libres.

La capacidad para eclosionar se mide como H%, Heficacia o Hrendimiento y tiene en cuenta el resultado final del procedimiento de eclosión, es decir, los nauplios nadantes libres. El porcentaje de eclosión (H%) es el número de nauplios nadantes libres que emergen de 100 quistes completos, la eficacia de eclosión (Heficacia) es el número de nauplios nadantes libres que eclosionan de un gramo de 50 producto quístico y el rendimiento de eclosión (Hrendimiento) es el peso de nauplios nadantes libres que eclosionan de un gramo de producto quístico.

Las razones por las que los embriones no pueden a veces continuar hacia la fase de nauplios nadantes se refieren fundamentalmente a las condiciones de incubación inadecuadas. Sin embargo, factores inherentes a los quistes pueden causar también este problema (por ejemplo, cantidad insuficiente 55 de energía almacenada). Además, en algunas cepas de Artemia o en algunos lotes dentro de la misma cepa un número más o menos grande de embriones, aunque viables, no son capaces de comenzar el procedimiento de eclosión. Para tales cepas o lotes los procedimientos o técnicas de acondicionamiento aplicados hasta ese momento han fracasado obviamente para desactivar la diapausa en todos los quistes

individuales, y con el fin de obtener el máximo número de nauplios nadantes libres serán necesarios procedimientos suplementarios y más específicos que desactiven la diapausa (Van Stappen, 1996).

Los procedimientos descritos incluyen almacenamiento prolongado de quistes secos en frío con oxígeno atómico, ciclos repetidos de hidratación-deshidratación, incubación con tiempos cortos en una disolución de sustancias químicas específicas (por ejemplo peróxido de hidrógeno). Estas técnicas son 5 específicas de las cepas y lotes, y además, los quistes responden frecuentemente de modo errático. Cuando no se realizan apropiadamente se pueden obtener incluso resultados adversos (por ejemplo, incubación en disoluciones químicas bajo combinaciones inadecuadas tiempo-dosis). Estas técnicas se han de aplicar además y después de las técnicas de tratamiento que hasta ese momento se han aplicado, es decir, por el usuario de los quistes. Requieren de éste mucho trabajo, experiencia y suficiente 10 conocimiento general de antecedentes de Artemia así como información específica sobre la cepa o lote particular a tratar. La ausencia de esto será origen de errores y/o resultados indeseables. La naturaleza de uso difícil de estas suplementarias técnicas específicas, desactivadoras de diapausa elimina una de las principales ventajas de los quistes de Artemia: una fuente de alimento fresco fácilmente disponible para acuicultura. 15

Un método que permite tratar quistes para aumentar el porcentaje de eclosión de ellos sin requerir muchas etapas de procedimiento se expone en el documento EP1195088. En este procedimiento se introduce peróxido de hidrógeno en el medio de eclosión en una cantidad seleccionada dentro del intervalo entre 0,5 y 30 mg/l de medio de eclosión, en el que los quistes se incuban en una densidad máxima de aproximadamente 5 g de materia seca quística por litro para aumentar el porcentaje de 20 eclosión desde X% del número total de quistes completos cuando los quistes no se ponen en contacto con peróxido de hidrógeno hasta un valor mayor que X% cuando se ponen en contacto con peróxido de hidrógeno.

Un inconveniente de este método es que la eclosión en este método depende de la cantidad de peróxido. Más concretamente, se necesita introducir una cantidad entre 0,5 y 30 mg/l en el medio de 25 eclosión para permitir interrumpir la diapausa en al menos un número de los quistes de Artemia en diapausa con el fin de permitir a tales quistes en diapausa producir nauplios nadantes libres dentro del periodo de incubación. A concentraciones de peróxido inferiores al intervalo de concentración óptima de peróxido, la eclosión no alcanza su valor máximo, a concentraciones de peróxido por encima del intervalo de concentración óptima de peróxido el peróxido es tóxico para los nauplios y esto se refleja en una 30 eclosión inferior al valor máximo. Este intervalo de concentraciones óptimas es muy pequeño, y como depende también de la cepa o lote de Artemia es necesario por tanto determinar por pruebas normalizadas el intervalo de concentraciones óptimas de peróxido para cada lote o cepa antes de que la dosificación...

1. Un método para producir nauplios de Artemia nadantes libres a partir de una cantidad de quistes de una o más especies de Artemia, que incluyen quistes en diapausa, incubando los quistes en un medio de eclosión en condiciones que permiten al menos a una parte de los quistes eclosionar y liberar nauplios nadantes libres, caracterizado porque los quistes se ponen en contacto con al 5 menos un compuesto que comprende al menos una estructura -C(OH)=C(OH)- para interrumpir la diapausa en al menos un número de dichos quistes en diapausa con el fin de permitirles producir nauplios nadantes libres, aumentando con ello el porcentaje de eclosión de los quistes incubados desde X% del número total de quistes completos cuando los quistes no se ponen en contacto con dicho compuesto hasta un porcentaje de eclosión mayor que X% cuando se ponen en contacto con 10 dicho compuesto.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho compuesto se introduce en dicho medio de eclosión.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto se introduce en el medio de eclosión en una cantidad mayor que 1 mg/l, en particular mayor que 3 mg/l, más 15 particularmente mayor que 5 mg/l y lo más particular mayor que 10 mg/l.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los quistes comprenden tal cantidad de quistes en diapausa que introduciendo una cantidad óptima de dicho compuesto en el medio de eclosión el porcentaje de eclosión puede aumentar desde X% hasta un porcentaje máximo de eclosión M% y dicha cantidad de dicho compuesto se selecciona para 20 aumentar el porcentaje de eclosión desde X% hasta un porcentaje de eclosión que es al menos igual a X% + 0,4*(M – X)%, y preferiblemente hasta un porcentaje de eclosión que es al menos igual a X% + 0,6*(M – X)%.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la estructura -(OH)C=C(OH)- de dicho compuesto es una parte de una subestructura aromática del 25 compuesto, siendo dicho compuesto seleccionado preferiblemente del grupo que comprende polifenoles y/o flavonoides, más preferiblemente polifenoles y/o flavonoides que contienen una estructura de catecol y/o galol.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho compuesto se introduce en el medio de eclosión menos de 10 horas, preferiblemente menos de 8 30 horas, más preferiblemente menos de 6 horas y lo más preferiblemente menos de 5 horas después de haber comenzado a incubar los quistes en ese medio.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho compuesto se introduce prácticamente al mismo tiempo que los quistes en el medio de eclosión, en particular siendo mezclado con los quistes y/o siendo adherido sobre éstos o revistiéndolos. 35

8. Un recipiente que contiene una cantidad de quistes de una especie o más de Artemia, quistes que se destinan a ser incubados en un medio de eclosión para producir nauplios nadantes libres y muestran un porcentaje de eclosión de X% del número total de quistes completos cuando son eclosionados en el medio de eclosión en ausencia de un compuesto que comprende al menos una estructura -(OH)C=C(OH)-, caracterizado porque dicho recipiente contiene además una cantidad de al menos 40 un compuesto que comprende al menos una estructura -(OH)C=C(OH)-, cantidad que es suficiente para aumentar el porcentaje de eclosión de dicha cantidad de quistes desde X% hasta un porcentaje de eclosión mayor que X% cuando esta cantidad de dicho compuesto se introduce en el medio de eclosión.

9. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque dicha cantidad de dicho 45 compuesto comprende al menos 1 mg/g de materia seca quística, preferiblemente al menos 2 mg/g de materia seca quística, más preferiblemente al menos 3 mg/g de materia seca quística y lo más preferiblemente al menos 5 mg/g de materia seca quística.

10. Un recipiente de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque dichos quistes comprenden una cantidad tal de quistes en diapausa que introduciendo una cantidad óptima de dicho 50 compuesto en el medio de eclosión el porcentaje de eclosión puede aumentar desde X% hasta un porcentaje máximo de eclosión M% y dicha cantidad del citado compuesto es tal que cuando la cantidad de quistes es eclosionada en presencia del mismo el porcentaje de eclosión es al menos igual a X% + 0,4*(M – X)%, y preferiblemente al menos igual a X% + 0,6*(M – X)%.

11. Un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la 55 estructura -(OH)C=C(OH)- de dicho compuesto es una parte de una subestructura aromática del

compuesto, siendo dicho compuesto seleccionado preferiblemente del grupo que comprende polifenoles y/o flavonoides, más preferiblemente polifenoles y/o flavonoides que contienen una estructura de catecol y/o galol.

12. Un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque contiene dicho compuesto incluido en un envase que separa este compuesto de los quistes. 5

13. Un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque dicho compuesto se mezcla con los quistes y/o se adhiere a éstos o los reviste.

14. Uso de un compuesto que comprende al menos una estructura -(OH)C=C(OH)- para aumentar el porcentaje de eclosión de una cantidad de quistes de una especie o más de Artemia, más particularmente de una cantidad de quistes que comprenden quistes en diapausa. 10