MÉTODO QUE UTILIZA UN ANIMAL TRANSGÉNICO CON RESPUESTA INMUNE POTENCIADA.

Método que utiliza un animal transgénico con respuesta inmune potenciada La presente invención se refiere al campo de la inmunología. De forma más específica, la invención se refiere a un animal transgénico no humano (Tg) capaz de desarrollar una respuesta inmune humoral potenciada contra un antígeno en comparación con un animal de control no transgénico de la misma especie, comprendiendo dicho animal transgénico no humano un constructo genético que provee una actividad potenciada del receptor Fc neonatal (FcRn) relacionado con un MHC de clase I. La invención proporciona un método no terapéutico para desarrollar una respuesta inmune humoral potenciada, utilizando tal método el citado animal transgénico no humano y un antígeno de interés. En respuesta al antígeno, las células plasmáticas se desarrollan a partir de los linfocitos B en una reacción inmune humoral específica que alcanza su máximo aproximadamente 1 a 2 semanas después del insulto antigénico. El encuentro secundario con el antígeno resulta en la secreción de anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno, un máximo incrementado de titulación de anticuerpo en suero específico y niveles persistentes de anticuerpos en suero. El mantenimiento de niveles de anticuerpo en suero específicos requiere la secreción continua de Ig por las células plasmáticas y su protección contra una eliminación rápida. Mientras IgM, IgA, IgE se eliminan de forma relativamente rápida del cuerpo, la vida media de la IgG en suero se prolonga. En 1958, Brambell describió un sistema de receptores saturables que mediaba el transporte de la IgG materna (Brambell, 1958); después, dedujo la presencia de un receptor similar o idéntico que protegía la IgG frente al catabolismo, para convertirla en la superviviente más longeva de todas las proteínas plasmáticas (Brambell y col., 1964). Se demostró finalmente que el receptor de Brambell (FcRB) mediaba la transmisión de la IgG en el período antenatal y/o neonatal, en esta expresión llamada FcRn (receptor de Fc neonatal) como la protección de la IgG contra el catabolismo (Junghans, 1997). El FcRn fue identificado en primer lugar en roedores como un receptor que transfería inmunoglobulinas maternales de la madre al recién nacido a través del intestino neonatal (Rodewald, 1976; Simister y Rees, 1985). Desde su descripción original en intestino neonatal de rata por Simister y Mostov (Simister and Mostov, 1989), varios estudios han demostrado que el FcRn desempeña un papel fundamental en la regulación del transporte de la IgG dentro y a través de células de diferente origen (Antohe y col., 2001; Claypool y col., 2004; Dickinson y col., 1999; Kobayashi y col., 2002; McCarthy y col., 2000; Ober y col., 2004; Spiekermann y col., 2002). También sirve para rescatar la IgG y la albúmina, las dos proteínas solubles más abundantes en el suero, de la degradación, prolongando así sus vidas medias (Ghetic y col., 1996; Israel y col., 1996; Junghans y Anderson, 1996). En un principio se pensó que el mecanismo estaba mediado por las células endoteliales que forran los vasos sanguíneos (Borvak y col., 1998); sin embargo, descubrimientos recientes sugieren que este proceso también tiene lugar en otras células (Akilesh y col., 2007; Lu y col., 2007). Dentro de estas células, el FcRn reside predominantemente en los endosomas tempranos/de reciclaje, donde encuentra la IgG y la albúmina internalizada mediante endocitosis en fase fluida. El ambiente ácido de los endosomas facilita la interacción. La IgM y la albúmina unidas se vuelven a reciclar en la superficie y se liberan de la célula, mientras que los ligandos no unidos son transportados aguas abajo hacia la degradación lisosomal (Anderson y col., 2006; Roopenian y Akilesh, 2007). Datos más recientes apoyan un nuevo concepto en el que el FcRn desempeña un papel importante en la fagocitosis mediada por IgG (Vidarsson y col., 2006). La molécula funcional de FcRn es un heterodímero compuesto por una cadena- (o cadena pesada) similar al MHC de clase I y la microglobulina beta 2 (ß2m; nombre alternativo: cadena ligera) (Simister y Mostov, 1989) que se une a la IgG y a la albúmina de forma dependiente del pH (Chaudhury y col., 2003; Simister y Mostov, 1989) aunque en distintos sitios de unión (Andersen y col., 2006; Chaudhury y col., 2006). Se ha clonado el FcRn a partir de una gran variedad de especies de mamíferos, entre ellas rata (Simister y Mostov, 1989), ratón (Ahouse y col., 1993), humano (Story y co., 1994), bovino (Kacskovics y col., 2000), zarigüeya (Adamski y col., 2000), oveja (Mayer y col., 2002), cerdo (Sche y Hurley, 2003; Zhao y col., 2003), camello y perro (Kacskovics y col., 2006b). Más recientemente, los presentes inventores clonaron y caracterizaron la cadena alfa del RcRn de conejo. Aunque la mayor parte de las funciones que cumple el FcRn se han descrito en ratones, estudios en otros mamíferos sugieren que el papel del FcRn en el catabolismo de la IgG es similarmente crucial en todos los mamíferos investigados, como roedores, humanos y primates (Ghetie y Ward, 2002), cerdo (Harmsen y col., 2005) y bovino (Kacskovics y col., 2006a). Se ha demostrado recientemente en dos modelos de ratón diferentes que la sobreexpresión de la cadena alfa del RcRn bovino (bFcRn) alargaba significativamente la vida media de la IgG de ratón en estos animales (Bender y col., 2007; Lu y col., 2007), indicando que el bFcRn forma un complejo funcional con la B2m (mß2m) de ratón y que se une a las IgG de ratón y humanas. Los presentes inventores descubrieron también que la sobreexpresión del bFcRn en ratones transgénicos (Tg) (ratones empleados como los que utilizaron Bender y col., 2007) permitía que estos animales produjeran un nivel significativamente elevado de IgG e IgM específicas del antígeno a su inmunización. La WO 2007061292 describe la preparación de anticuerpos monoclonales donde células productoras de anticuerpos son transfectadas con un ácido nucleico que codifica el gen para FcRn. Las células modificadas expresan FcRn y la producción de anticuerpos es elevada. Los autores no proporcionan la divulgación adecuada sobre la 2   preparación de animales transgénicos ni sobre los animales mismos, no obstante mencionan las ventajas de animales no humanos con al menos una copia (adicional) de ácido nucleico que codifica FcRn para sobrerregular los niveles de anticuerpos en sangre. Sin embargo, la enseñanza es claramente teórica y se basa en su descripción, que enfoca la producción de anticuerpos monoclonales in vivo, por ejemplo en el líquido ascítico de la rata. No indican tampoco la ventaja de la sobreexpresión de FcRn en la potenciación de la respuesta inmune. Queda claro que sigue existiendo la necesidad en la técnica de una provisión mejorada de inmunoglobulina terapéutica, de investigación y de diagnóstico de alta calidad y cantidad. Para cumplir con esta necesidad, la presente invención proporciona animales transgénicos que responden a retos antigénicos con un nivel sorprendentemente elevado de reacción inmune humoral específica. Se descubrió sorprendentemente que con ratones BAC Tg con una sobreexpresión dependiente del número de copias de la cadena- de FcRn bovino (codificado por el gen FCGRT bovino) no ólo s resultó en que la cadena- de FcRn bovino formaba un complejo funcional con ß2m de rat ón y aumentaba significativamente la vida media de la IgG humana y de ratón administrada exógenamente, sino que estos animales transgénicos mostraban también una respuesta inmune humoral sorprendentemente incrementada a su inmunización en comparación con sus controles de tipo salvaje. La mayoría de los anticuerpos específicos para el antígeno fueron IgG, sin embargo el título de IgM aumentó también durante la respuesta inmune secundaria. A la hora de analizar las posibles razones, los presentes inventores detectaron un número significativamente mayor de células-B específicas del antígeno, células dendríticas y un influjo masivo de neutrófilos en los órganos linfoides secundarios a la inmunización en el ratón transgénico con BFcRn en comparación con sus controles de tipo salvaje. Se debe mencionar que se observaron cambios similares, aunque menos sorprendentes, en los controles de tipo salvaje. Como consecuencia, se podría demostrar que los niveles en aumento de IgG e IgM específicas para el antígeno en los animales Tg bFcRn resultaban no sólo de la protección incrementada de la IgG sino también de la mayor expansión clonal de células-B específicas del antígeno y, por consiguiente, de una síntesis más resistente de la inmunoglobulina en comparación con sus controles de tipo salvaje. Estos resultados señalan un nuevo papel para el FcRn en la respuesta inmune. La presente invención es la primera en revelar que, debido al notable estado del FcRn sobreexpresado... [Seguir leyendo]

1. Método no terapéutico para desarrollar una respuesta inmune humoral potenciada, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto un animal transgénico (Tg) no humano con un antígeno de interés, comprendiendo el animal Tg no humano un constructo genético, caracterizado porque dicho constructo genético prevé la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena- de la proteína de FcRn, y caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena- de la proteína de FcRn se sobreexpresa, previendo así el constructo genético la protección potenciada de la IgG contra la degradación así como la respuesta inmune humoral potenciada contra dicho antígeno en comparación con un animal de control no transgénico de la misma especie. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho constructo genético prevé la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena- bovina de la prote ína de FcRn o codifica para una cadena- que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 60% o ás mcon la secuencia de la proteína de FcRn bovino. 57   centrómero telómero 58 Valor Ct   ß-actina de ratón pulmón Densidad Valor Ct Figura 3 hígado intestino gándula mamaria número de genes bFcRn integrados Figura 4 Figura 5 59   vida media (horas: AVG+SEM) vida media (horas: AVG+SEM) tiempo (horas) tiempo (horas) Figura 6 IgM anti-OVA (título) título log)   Recuento tiempo (días) inmunización inmunización IgG anti-OVA (título) nivel IgG en suero total (mg/ml) Figura 7 61 inmunización tiempo (días) tiempo (días) anti-OVA / células 10 6   IgM anti-FITC (título) inmunización tamaño bazo (g) tiempo (días) 62 número de células (10 8 )   63   64   inmunizado con OVA inmunizado con OVA inmunizado con OVA inmunizado con OVA no-inmunizado no-inmunizado inmunizado con OVA   conc. albúmina en suero wt_KO_tg4_tg10 66   conc. IgG de conejo (g/ml) tiempo (horas) 67