MÉTODO PARA RECLONAR CÉLULAS DE PRODUCCIÓN.

La presente invención se refiere al sector de la tecnología del cultivo celular y al uso de una célula de hámster como células feeder para la reproducción o multiplicación/clonación de células de hámster autógenas que crecen en suspensión en unas condiciones sin suero. Fundamento de la invención Para la fabricación biotecnológica de proteínas terapéuticas o activas desde el punto de vista biológico en células mamíferas, los llamados biofármacos, las correspondientes células mamíferas son transinfectadas de forma estable con el ADN, que codifica la correspondiente proteína biológicamente activa (o bien sus subunidades). Tras el proceso de transinfección normalmente se obtiene una acumulación de millones de células transinfectadas de forma diferente. Por tanto la etapa decisiva para la fabricación de estirpes celulares de producción eficientes se basa en la selección y reproducción de clones celulares, que por un lado crecen de forma muy estable y por otro lado muestran una elevada productividad específica de proteínas terapéuticas (formación del producto, etc.). Puesto que existen millones de células que expresan el producto de forma distinta, resulta decisivo poder analizar individualmente una multitud de células, para poder elegir los candidatos apropiados (clones celulares individuales), que crecen de forma muy robusta así como aportan un valor o título de producto asimismo elevado. Este proceso de aislamiento de células individuales y de subcultivo se conoce como clonación o bien reclonación. La selección de células transinfectadas es posible, por ejemplo, a través de la clasificación o selección celular activada por la fluorescencia (FACS), de manera que la expresión de la proteína terapéutica se relacione con la expresión de una proteína marcador. Para ello se expresan conjuntamente en una célula, por ejemplo, las proteínas que emiten fluorescencia y sus variantes de Aequorea victoria, Renilla reniformis o bien otras especies, como por ejemplo, las proteínas rojas, amarillas, violetas, verdes fluorescentes o sus variantes de organismos no bioluminiscentes como, por ejemplo, Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthis sp., junto con la proteína terapéutica. Sobre la intensidad de la fluorescencia se pueden sacar conclusiones respecto a la productividad específica y al comportamiento del crecimiento de las células. Sin embargo, existe la dificultad de depositar las células de producción recombinantes típicas como las células de mieloma (NSO) de ratón, ovario de hámster (CHO) o riñón de hámster (BHK), en particular, cuando se adaptan al crecimiento en cultivos de suspensión libres de suero, es decir en unas modernas condiciones del cultivo celular relevantes en cuanto a la producción, de forma aislada en recipientes de cultivo, por ejemplo, en las cavidades de las microplacas, en cultivos libres de suero, y se multiplican de forma eficiente (reclonación). Por ejemplo, en un cultivo en unas condiciones sin suero se depositan solamente escasas células, menos de 5 células, por lo que estas células mayoritariamente no se reproducen o si lo hacen se reproducen de forma poco eficaz. Se sospecha que el motivo de ello no reside en el contacto existente entre célula y célula, en la necesidad de un gran factor de crecimiento /nutriente en el caso de una densidad celular escasa y/o si falta o existe una concentración mínima de factores de señalización y acondicionamiento difusibles. A nivel técnico el problema de la clonación de células aisladas libres de suero en las células de producción recombinantes mencionadas consiste en que los clones celulares son generados conforme al método de la limited dilution. Es decir, se saturan un mínimo de 5 hasta 10 células en un medio sin suero en un recipiente de cultivo y seguidamente se hacen pasar por reiteradas clonaciones de la dilución, para obtener desde el punto de vista estadístico un cultivo formado por células genéticamente idénticas (método = limited dilution). Este tipo de reclonación ahorra tiempo por un lado y por otro conduce a cultivos de mezcla heterogénea desde el punto de vista genético, puesto que el procedimiento se basa en un cálculo estadístico y no en un cultivo real de cada una de las células idénticas genéticamente depositadas de forma aislada. Estos cultivos de mezcla heterogéneos se caracterizan en general por una limitada fortaleza en su fermentación y un perfil de expresión heterológico. Alternativamente, se pueden generar estirpes celulares de producción relevante de clones de células aisladas solamente por deposición de cada célula de las células adherentes adaptadas al suero. Así Meng y cols. (2000) mencionan por ejemplo, un método para la deposición de células aisladas de células CHO que crecen adheridas en un medio que contiene suero. El método descrito por Meng y cols., tiene sin embargo un inconveniente importante: Debido a la adherencia de las células puede producir unas lesiones notables en las células y alteraciones en el crecimiento y en la productividad de las células reclonadas debido a la costosa disolución enzimática de las células de la base (tratamiento con tripsina). Además los clones de las células aisladas obtenidos se deben adaptar seguidamente al crecimiento libre de suero en un cultivo, lo que ordinariamente está ligado a un gasto elevado de tiempo así como a una productividad alterada de células y de calidad del producto (compárese aquí con Kaufmann y cols., 2001; Mueller y cols., 1999). Mediante el empleo de células nutritivas, conocidas también como células feeder, al cultivar células que crecen de forma adherente se pueden ver influidas de forma positiva las propiedades de crecimiento de las células o bien se reproducen algunos tipos de células básicamente en las condiciones del cultivo celular. Aquí los ejemplos son 2   células de hombre-ratón o bien de hibridoma de ratón-ratón (Hinak y cols., US 5.008,198), queratinocitos primarios (Rheinwald y Green, 1975;WO9954435), células madre (Williams y cols.,1988) y diferentes células tumorales (Wee Eng Lim y cols., 2002;Rexroad y cols.,1997;Peng y cols.,1996; Grigoriev y cols.,1996; Sanchez y cols.,1991; Butcher y cols.,1988;Long y cols.,1986; Shenyour y cols.,1984;Pintus y cols.,1983;Brodin y cols.,1983). Las células feeder son la mayoría células detenidas en su crecimiento física o químicamente, las cuales debido a un pretratamiento especial han ajustado su capacidad para la división celular, por lo que se mantienen vitales una media de 2 a 3 semanas. Por lo tanto las células feeder están en condiciones de aportar factores al medio que favorezcan el crecimiento y por lo tanto pueden favorecer el crecimiento inicial de células no retenidas o bien facilitarlo en el caso de diferentes células primarias. Para ello se colocarán las células feeder en un recipiente de cultivo formando una monocapa. A continuación, se colocan en placas las células que se van a cultivar de forma adherente sobre o entre las células feeder y se cultivan en unas condiciones estándar. Las células feeder se pueden fabricar, por ejemplo, mediante irradiación o tratamiento con mitomicina C (Azirino(2,3:3,4)pirrolo(1,2-a)indol-4,7-diona,6-amino-8- [[aminocarbonil)oxi]metil]-1,1a,2,8,8a,8b-hexahidro-8a-metoxi-5-metil-,[1aR-(1a.alfa.,8.beta.,8a.alfa.,8b.alfa.)] (9Cl) (Butcher y cols, 1988). Las células primarias como las células del bazo, los fibroblastos, las células sanguíneas (Morgan, Darling;Kultur tierischer Zellen. Spectrum Akademischer Verlag 1994, pág 115f) y los macrófagos (Hlinak y cols.,1987) se han descrito en los sistemas celulares Feeder. En relación con la producción de anticuerpos en las células del hibridoma se ha descrito la utilización de células feeder y la selección celular basada en FACS. Hlinak y cols. (1987), por ejemplo, describen una eficacia de reclonación del 33 hasta del 57% en la reclonación de células del hibridoma que crecen de forma adherente a base de dos (2) células por recipiente de cultivo. En las células del hibridoma empleadas se trataba en general de células adaptadas a un medio que contiene suero y que crece de forma adherente. En la utilización de células feeder heterogéneas, en especial de células feeder humanas para la generación de células de producción existe un riesgo de contaminación considerable por el virus de la enfermedad, como por ejemplo, virus, bacterias o micoplasmas. Además muchas de las células feeder (primarias) descritas necesitan un medio que contiene suero, lo que inicialmente incrementa el riesgo de la contaminación y en segundo lugar tiene el riesgo de que se deben readaptar células de producción adaptadas al crecimiento libre de suero lo que resulta caro. En la utilización de células feeder heterogéneas, en general, se necesita una contraselección de células... [Seguir leyendo]

1. Utilización de una célula de hámster como célula feeder para la reproducción/clonación de células de hámster autógenas que crecen en suspensión en unas condiciones sin suero, que se caracteriza por que la célula hámster empleada como célula feeder se adapta a unas condiciones de cultivo sin suero y se mantiene asimismo en suspensión, por lo que la célula hámster empleada como célula feeder es inactivada física o químicamente. 2. Utilización conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por, que la célula que va a ser reproducida es una estirpe celular, que es importante para la producción de los biofármacos. 3. Utilización conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza por, que se trata de un uso en un método para la reclonación de células. 4. Utilización conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por, que la célula de hámster empleada como célula feeder es inactivada por la irradiación. 5. Utilización conforme a la reivindicación 4, que se caracteriza por, que la dosis de energía de la radiación es de 20-500 Gy 6. Utilización conforme a una de las reivindicaciones anteriores 1 hasta 5, que se caracteriza por, que la célula de hámster empleada como célula feeder equivale a una célula conforme a la tabla siguiente: Estirpe celular Número de consigna BHK21 ATCC CCL-10 BHK TK- ECACC No. 85011423 HaK ATCC CCL-15 2254-62.2 (Derivado BHK-21) ATCC CRL-8544 CHO ECACC No. 8505302 CHO-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (= CHO duk-, CHO/dhf() ATCC CRL-9096 CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Urlaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 CHL ECACC No. 87111906 o bien a un derivado o descendiente de dicha célula o estirpe celular. 7. Utilización conforme a la reivindicación 6 que se caracteriza por, que la célula de hámster utilizada como célula feeder es una célula CHO o BHK, o descendientes o derivados de estas estirpes celulares. 8. Utilización conforme a la reivindicación 7 que se caracteriza por, que la célula de hámster utilizada como célula feeder es una célula CHO. 9. Utilización conforme a la reivindicación 8 que se caracteriza por, que la célula CHO es una célula DG44. 16