MÉTODO PARA PRODUCIR CEPAS RUGOSAS DE BACTERIAS Y SUS USOS.

Método para producir cepas rugosas de bacterias y sus usos CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a cepas rugosas de bacterias, tales como las del género Mycobacterium. En particular, la presente invención se refiere a métodos para obtener cepas rugosas de bacterias. La presente invención se refiere además a una nueva cepa rugosa de Mycobacterium obuense y al uso de esta cepa rugosa de Mycobacterium obuense. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los métodos para obtener cepas rugosas de bacterias, tales como las del género Mycobacterium, que son conocidos en la técnica incluyen el cultivo en placa de bacterias, tales como las del género Mycobacterium, y la búsqueda de cualquier colonia rugosa. Sin embargo, típicamente, ninguna cepa rugosa identificada de este modo es estable. Otros métodos incluyen cultivar en placa micobacterias sobre un medio que contiene Tween o glicerol y fomentar el crecimiento de película. Este método ha sido satisfactorio para inducir colonias rugosas de algunas especies de micobacterias. Sin embargo, este método no ha sido capaz de inducir variantes rugosas en todas las micobacterias. Ningún método ha sido capaz hasta la fecha de inducir cepas rugosas de Mycobacterium obuense. De acuerdo con esto, hay una necesidad de un método mejorado que sea capaz de producir cepas rugosas, particularmente cepas rugosas estables, de Mycobacterium. Tal método podría usarse ventajosamente para producir por primera vez cepas rugosas de algunas especies de Mycobacterium tales como Mycobacterium obuense. Ventajosamente, la presente invención ha proporcionado tal método mejorado que ha inducido por primera vez una cepa rugosa, particularmente una cepa rugosa estable, de Mycobacterium obuense. Las cepas rugosas de micobacterias de crecimiento rápido tienen un número de ventajas: - las cepas rugosas estables no revierten a cepas lisas; - las cepas rugosas tienen una presentación de antígenos diferente y tienden a ser menos virulentas en causar una enfermedad que las cepas lisas; - los reactivos para pruebas cutáneas elaborados a partir de cepas rugosas son más eficaces que los elaborados a partir de cepas lisas; - las cepas rugosas son muy eficaces cuando se usan en experimentos inmunológicos mediados por células in vitro; y - los pequeños agregados o partículas de varios bacilos pueden ser más eficaces para estimular células fagocíticas que organismos individuales de cepas lisas. Por otra parte, la presente invención ha encontrado ventajosamente que se puede usar una célula entera de un cepa rugosa de Mycobacterium obuense para modular la respuesta inmune de un sujeto. Aunque se sabía que M. vaccae modula la respuesta inmune de un sujeto - M. obuense nunca se ha considerado antes adecuada para el uso como un inmunomodulador. Las vacunas y otros inmunomoduladores tienen un impacto importante en la reducción de la morbilidad y mortalidad por enfermedad. La inmunidad primaria producida por la mayoría de las vacunas actuales parece estar mediada por la respuesta inmune humoral. Para enfermedades que pueden requerir una respuesta celular inmune, tales como tuberculosis y leishmaniasis, actualmente no hay vacunas disponibles que sean uniformemente eficaces. 2   Típicamente, se añaden adyuvantes a las vacunas. El papel del adyuvante es potenciar la respuesta inmune del cuerpo a antígenos específicos de la vacuna. Los adyuvantes comúnmente usados producen típicamente una respuesta inmune humoral pero no producen una respuesta inmune mediada por células. Además, los adyuvantes de aluminio, por ejemplo, pueden provocar efectos secundarios negativos, tales como abscesos estériles, eritema, hinchazón, nódulos subcutáneos, inflamación granulomatosa e hipersensibilidad por contacto. Se busca una vacuna u otro inmunomodulador que modifique una respuesta celular inmune y en particular la respuesta de células T auxiliares, por ejemplo, la respuesta de células T auxiliares 1 (Th1) y células T auxiliares 2 (Th2). Hay muchas enfermedades autoinmunes diferentes, y cada una puede afectar al cuerpo de diferentes modos. Muchas de las enfermedades autoinmunes son raras. Sin embargo, como grupo, las enfermedades autoinmunes afectan a millones de personas. Se sabe que algunas enfermedades autoinmunes comienzan o empeoran con ciertos activadores tales como infecciones virales, parasitarias y bacterianas crónicas. Otras influencias menos comprendidas que afectan al sistema inmunológico y al curso de enfermedades autoinmunes incluyen envejecimiento, estrés crónico, hormonas y embarazo. Las enfermedades autoinmunes a menudo son crónicas, requiriendo cuidado y control de por vida, incluso cuando la persona pueda parecer o sentirse bien. Actualmente, pocas enfermedades autoinmunes pueden curarse o hacerse remitir con tratamiento. Muy a menudo, los médicos ayudan a los pacientes a manejar las consecuencias de la inflamación provocada por la enfermedad autoinmune. En algunas personas, un número limitado de medicaciones inmunosupresoras puede dar como resultado una remisión de la enfermedad. Sin embargo, incluso si su enfermedad remite, los pacientes raramente son capaces de suspender la medicación. Los efectos secundarios a largo plazo de la medicación inmunosupresora pueden ser sustanciales. La iniciación y la progresión de una lesión vascular es un proceso multifactorial complejo, pero hay una evidencia creciente de que las respuestas inflamatorias representan un papel clave. La lesión vascular está implicada en el desarrollo de la aterosclerosis, y en procesos trombóticos que conducen a síndromes isquémicos agudos tales como infarto de miocardio, apoplejía y oclusión de arterias periféricas. Los mecanismos inmunes pueden ser importantes en el desarrollo y el mantenimiento de la aterosclerosis y la hiperplasia mioíntima (MIH). La hiperplasia mioíntima (MIH) puede considerarse una respuesta de curación exagerada a una lesión tal como angioplastia con globo. Una cascada de episodios da como resultado: pérdida de la membrana de basamento, migración de células del músculo liso vascular (VSMC) del medio hacia la íntima, proliferación de VSMC y cambio fenotípico hasta un tipo de célula fibroblástica más secretora y producción incrementada de matriz extracelular, que finalmente conduce a estenosis u oclusión del vaso. Se produce después de injerto de baipás y angioplastia con globo y afecta a aproximadamente 30% de tales casos en la práctica clínica. Es la principal causa de fallo de tales procedimientos y el tratamiento de los vasos/injertos estenosados y bloqueados es problemático. Los mecanismos celulares subyacentes que conducen a MIH no son bien comprendidos y hasta ahora no se ha desarrollado una terapia que pueda prevenirla eficazmente. La relevancia clínica de la presente patente se refiere a los números muy grandes de angioplastias de arterias coronarias que se realizan anualmente en el Reino Unido y en todo el mundo. Aunque las prótesis endovasculares (stents) liberadoras de fármacos están produciendo actualmente resultados prometedores, es improbable que eviten completamente la reestenosis. Cualquier terapia accesoria segura relativamente económica, tal como la inmunoterapia propuesta en esta patente, tendría un importante impacto clínico. Los mecanismos implicados en la inmunoterapia contra la reestenosis son complejos y no están completamente aclarados. La lesión endotelial provocada por la angioplastia puede ser exacerbada por la respuesta inmune del huésped a hsp. Las hsp son proteínas producidas por células estresadas que se han relacionado con la patogénesis y la patofisiología de diversos trastornos inmunológicos incluyendo la aterosclerosis (Xu Q et ál. Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799). Es probable que estén presentes sobre células endoteliales y del músculo liso en la región de una angioplastia. En efecto, la hsp actúa como un autoantígeno que puede ser atacado por el sistema inmunológico. Esta situación puede inducirse experimentalmente al inmunizar con una hsp micobacteriana reactiva cruzadamente (hsp65) que conduce a daño endotelial en conejos y ratones (Xu Q et ál. Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799 y George J, et ál. Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210). El efecto parece depender de IL-4 secretada por linfocitos Th2, y probablemente está mediado por anticuerpo (George J, et ál. Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210 y Schett G, et ál. J. Clin. Invest. 1995; 96: 2569-2577). La relevancia de estas observaciones para el ser humano se sugiere por la 3   capacidad para dañar células endoteliales humanas estresadas del anticuerpo humano purificado por afinidad eluido de columnas de hsp65 in vitro. Este hallazgo sugiere que el anticuerpo reacciona cruzadamente con hsp60, que es el homólogo humano de hsp65, y puede ser accesible al anticuerpo cuando se expresa sobre las membranas de células endoteliales... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir cepas rugosas de una bacteria, comprendiendo dicho método exponer dicha bacteria a 4,4-diaminodifenilsulfona en una cantidad que es mayor que o igual a 7,5 µg/ml y que 20 µg/ml, en el que dicha bacteria es de un género Mycobacterium aerobio. 2. Un método según la reivindicación 1, en el que se aísla dicha cepa rugosa. 3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha bacteria es Mycobacterium obuense. 4. Una cepa rugosa de Mycobacterium obuense producible mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5. Una cepa rugosa de Mycobacterium obuense depositada bajo el Tratado de Budapest en la NCTC con el número de registro NCTC 13365. 6. Una composición inmunomoduladora que comprende una célula entera de una cepa rugosa de Mycobacterium obuense, en donde dicha composición inmunomoduladora modifica una respuesta celular inmune durante el uso. 7. Una composición inmunomoduladora según la reivindicación 6, en donde dicha composición comprende una célula entera de una cepa rugosa de Mycobacterium obuense según la reivindicación 4 o la reivindicación 5. 8. La composición inmunomoduladora según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que comprende una célula entera de una bacteria procedente de una cepa rugosa de Mycobacterium obuense y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, composición modifica una respuesta celular inmune que durante el uso. 9. Una composición inmunomoduladora según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para el uso como un medicamento. 10. Una composición inmunomoduladora según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde dicha composición comprende además un antígeno o determinante antigénico. 11. Una composición inmunomoduladora según la reivindicación 10, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un antígeno o determinante antigénico seleccionado de uno o más de una vacuna de BCG (bacilo de Calmette y Guerin), una vacuna de toxoide de la difteria, una vacuna de difteria/tétanos/pertussis, una vacuna de pertussis, la vacuna del toxoide del tétanos, la vacuna del sarampión, la vacuna de las paperas, la vacuna de la rubeola, la vacuna OPV (vacuna oral de la poliomielitis) y Mycobacterium vaccae, o una de sus partes. 12. Una composición inmunomoduladora según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde dicha composición comprende dos o más de tales antígenos o determinantes antigénicos. 13. Una composición inmunomoduladora según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la que se mata dicha bacteria. 14. Uso de 4,4-diaminodifenilsulfona para producir una cepa rugosa de una bacteria, en el que dicha bacteria es del género Mycobacterium aerobio.