MARCADORES PARA CÉLULAS PRECANCEROSAS Y CANCEROSAS Y MÉTODO PARA INTERFERIR CON LA PROLIFERACIÓN CELULAR.

Moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano aislado que comprenden el ARN ribosómico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleótido con una secuencia repetida invertida

Marcadores para células precancerosas y cancerosas y método para interferir con la proliferación celular. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la terapia del cáncer, el diagnóstico del cáncer y reactivos para la investigación en relación con una nueva familia de ARNs (Ácidos ribonucleicos) mitocondriales humanos, mencionados como ARNs quiméricos mitocondriales. Particularmente la invención concierne a oligonucleótidos dirigidos a los ARNs mitocondriales humanos quiméricos. Los oligonucleótidos de la invención hibridizan con los ARNs mitocondriales humanos quiméricos induciendo la muerte de las células cancerosas. Las composiciones y los métodos provistos en la invención son útiles como una nueva terapia del cáncer. Además, los oligonucleótidos pueden ser usados en el diagnóstico de células cancerosas y precancerosas basado en la expresión diferencial de los ARNs quiméricos mitocondriales en células normales en reposo y en proliferación, células precancerosas y cancerosas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Mitocondrias Las mitocondrias son organelos subcelulares que sintetizan la adenosina trifosfato (ATP), molécula esencial para el metabolismo, mediante la fosforilación oxidativa. El ADN mitocondrial humano (ADNmt) de 16.654 pares de bases (pb) codifica dos ARN ribosomales (ARNr), 22 ARN de transferencia (ARNt) y 13 marcos de lectura (ORF) que codifican un número similar de polipéptidos (Clayton, 2000; Taanman, 1999). En base del contenido de bases G+T, las dos hebras del ADNmt difieren en su densidad de flotación* y pueden ser separadas en gradientes desnaturalizantes de cloruro de cesio. La hebra pesada (hebra H) codifica los dos ARN ribosomales (12S y 16S), 14 ARNt y 12 polipéptidos que corresponden a ND 1, ND 2, ND 3, ND4L, ND4, ND 5, COX I COX II, COX III, ATP6, ATP8 y Cyt b. La hebra liviana (hebra L) codifica 8 ARNts y la subunidad ND6 del complejo NAD deshidrogenasa (Clayton, 2000; Taanman, 1999). Una alta proporción del ADNmt contiene una estructura corta de tres hebras llamada el lazo de desplazamiento o lazo D. Esta región, que en seres humanos tiene 1.006 pares de bases está limitada por los genes de los ARNts para fenilalanina (tARN Phe ) y para prolina (tARN Pro ). Ella contiene una hebra corta de ácido nucleico, complementaria a la hebra L, que desplaza la hebra H (Clayton, 2000; Taanman, 1999). Esta región ha evolucionado como el sitio principal de control de la expresión de ADNmt, conteniendo el origen de la replicación de la hebra H, y los promotores principales de la transcripción de las hebras H (HSP) y L (LSP). A pesar de la cercanía de los sitios HSP y LSP (cerca de 150 pares de bases), estos reguladores son independientes funcionalmente tanto in vitro (Shuey y Atardi, 1985; Taanman, 1999) como in vivo, usando el modelo de pacientes con enfermedades mitocondriales (Chinnery y Turnbull, 2000). Ambas hebras se transcriben como ARNs policistrónicos que son luego procesados para liberar los ARNms, ARNts y ARNrs (Taanman, 1999). En seres humanos la ARN polimerasa mitocondrial es una proteína de 1.230 aminoácidos con una homología significativa con la secuencia de la ARN polimerasa mitocondrial de levaduras y las ARN polimerasas de varios bacteriófagos (Tiranti y colab. 1997). Además, se ha caracterizado una familia de factores de transcripción tal como el factor A o TFAM, que es esencial para la transcripción del ADNmt de mamíferos y es un miembro de la familia de proteínas de alta movilidad (HMG-box) que se unen al ADN (Parisi y Clayton, 1991). Recientemente, dos informes independientes han descrito las características de nuevos factores de transcripción, TBF1M y TBF2M en seres humanos y ratones (McCulloch y colab., 2002; Falkenberg y colab., 2002; Rantanen y colab., 2003). A pesar del considerable progreso en los elementos involucrados en la transcripción del ADNmt, que actúan en cis y trans, los detalles funcionales no se conocen completamente. Mitocondrias y Apoptosis. ES 2 365 511 T3 Las mitocondrias cumplen un papel central en la apoptosis, un proceso fundamental por el cual las células mueren en un proceso controlado o programado. Este programa de suicidio celular es esencial durante el desarrollo y para la homeostasis de todos los metazoos. La apoptosis es activada para eliminar células superfluas, dañadas, mutadas o envejecidas (Meier y colab., 2000). La desregulación de la apoptosis está implicada en la aparición de diversas patologías. Así la inhibición anormal de la apoptosis es la característica de las neoplasias, mientras que la apoptosis masiva se ha relacionado con enfermedades agudas tales como el infarto, shock séptico y enfermedades neurodegenerativas. Actualmente la apoptosis se describe basada en dos vías principales denominadas la vía extrínseca y la vía intrínseca (Zörnig y colab., 2001). La vía extrínseca corresponde a un proceso iniciado en la membrana celular por la unión de ligandos diferentes a los receptores de muerte celular (Krammer, 2000; Zörnig y colab., 2001). 2 Las caspasas son enzimas responsables de la cascada proteolítica en la apoptosis. Las caspasas son sintetizadas como proteínas precursoras inactivas que experimentan una maduración o proceso proteolítico durante la inducción de la apoptosis (Zörnig y colab., 2001). Sin embargo, hay diversas evidencias experimentales nuevas que indican que las proteasas lisosomales constituyen una ruta alternativa de proteolisis luego de daños apoptóticos (Guicciardi y colab., 2004). Por otra parte se han descrito proteínas antiapoptosis, homólogas a la oncoproteína humana Bcl-2. Esta proteína pertenece a una familia de proteínas que son anti apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w) o pro-apoptosis (Bax, Bak, Bim, Bid, etc.) (Zörnig y colab., 2001). Las mitocondrias son especialmente afectadas en forma temprana durante el proceso de apoptosis y actualmente son reconocidas como las coordinadoras centrales de la muerte celular (Boya y colab., 2003; Ferri y Kroemer, 2001; Zörnig y colab., 2001). Varias rutas de señales pro apoptóticas y de daño convergen en las mitocondrias induciendo la permeabilización de la membrana mitocondrial, fenómeno que está bajo el control de las proteínas Bcl-2 (Boya y colab., 2003; Zörnig y colab., 2001). Después que las células reciben daños apoptóticos, el potencial transmembrana (m) se disipa resultando en una completa permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la consecuente salida de proteínas mitocondriales tóxicas. El primer ejemplo de la filtración de una proteína mitocondrial fue la liberación de citocromo c (Liu y colab., 2001). Al estar presente el citocromo c en el citosol, se induce el ensamblaje del complejo de activación de caspasas llamado apoptosoma. El citocromo c se une al Apaf-1 (Factor-1 de activación de proteasas apoptóticas) facilitando la unión de dATP/ATP al complejo y la oligomerización de Apaf-1 (Adrain y colab., 1999; Benedict y colab, 2000). La oligomerización de Apaf-1 permite el reclutamiento de procaspasa-9, la que cataliza activación proteolítica del precursor y la producción de caspasa-9 activa.(Adrain y colab., 1994; Benedict y colab., 2000). Se ha descrito una familia de inhibidores citosólicos de las proteínas de la apoptosis que se conocen como XIAP, c- IAP1 y c-IAP2. Dichas proteínas se unen, e inhiben a las caspasa-3 y la caspasa-9 deteniendo la cascada de degradación. Sin embargo las células contienen mecanismos para eludir esta ruta antiapoptótica. En células en apoptosis las caspasas se liberan de la barrera inhibitoria uniéndose a IAPs de una proteína conocida como Smac* (Segundo activador mitocondrial de caspasas) o DIABLO (Proteína que se une a IAP a pH bajo) (Verhagen y colab., 2002). Al unirse a IAPs, Smac/DIABLO desplazan las caspasas activas de las IAPs promoviendo la muerte celular. Otra proteína, conocida como HtrA2, se libera de la mitocondria al citosol después de un daño apoptótico, lugar donde se une a las IAPs en forma similar a Smac/DIABLO facilitando así la activación de las caspasas (Verhagen y colab., 2002; Martins y colab., 2001; Suzuki y colab., 2001; Hedge y colab., 2002). El factor de inducción de apoptosis (AIF) es otro componente de la cascada apoptótica. Después de inducida la apoptosis, el AIF se traslada al citosol y al núcleo. En el núcleo, el AIF induce la condensación de la cromatina periférica y la fragmentación del ADN. El AIF también induce otras características de la apoptosis como la disipación de m, y la exposición de fosfatidilserina (Zörnig y colab., 2001). Un factor que parece regular la actividad apoptótica de AIF es la proteína de shock térmico 70 (Ravagnan y colab., 2001). Otro factor mitocondrial que se traslada al núcleo igual que el AIF es la endonucleasa G o Endo G. En el núcleo, Endo G produce la fragmentación del ADN incluso en presencia de inhibidores... [Seguir leyendo]

1. Moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano aislado que comprenden el ARN ribosómico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5 al extremo 3 de un polinucleótido con una secuencia repetida invertida. 2. Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARNs comprenden la secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, y SEQ ID NO 6. 3. Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARNs comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 4. 4. Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARN comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 5. 5. Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARNs comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 6. 6. Uso de uno o más compuestos u oligonucleótidos de 10 a 50 bases de longitud que son suficientemente complementarios a dicha molécula de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para poder hibridar con esa molécula de ARN quimérico mitocondrial humano para formar una pareja estable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o precáncer. 7. Uso según la reivindicación 6, en el que los compuestos u oligonucleótidos se seleccionan de las SEQ ID NOS. 9-97. 8. Uso según la reivindicación 6, en el que los compuestos u oligonucleótidos son oligonucleótidos de 15 a 50 bases de longitud en los que al menos 15 bases son complementarias a SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y/o SEQ ID No. 6. 9. Uso según la reivindicación 8, en el que en los oligonucleótidos tienen 18-50 bases de longitud. 10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que dicho medicamento puede inducir al menos una de muerte de células precancerosas y muerte de células cancerosas en células o tejidos. 11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que dicho medicamento está adaptado para la administración conjuntamente con una droga quimioterapéutica para el tratamiento del cáncer. 12. Método de detección seleccionado de ES 2 365 511 T3 (A) un método para distinguir entre células normales y células pre-cancerosas o cancerosas que comprende las etapas de: determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1; (B) un método para distinguir entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células pre-cancerosas y células cancerosas, que comprende las etapas de: determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 2; y (C) un método en el que células transformadas con virus ARN se distinguen de células cancerosas o células normales, que comprende la etapa de determinar el nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 3, y en el que dichas etapas de determinación no se llevan a cabo in vivo. 67 ES 2 365 511 T3 13. Método de detección para distinguir entre células normales y células precancerosas o cancerosas según la reivindicación 12, que comprende las etapas de: determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1. 14. Método de detección para distinguir entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células precancerosas y células cancerosas según la reivindicación 12, que comprende las etapas de: determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No 2. 15. Método de detección según la reivindicación 12, en el que células transformadas con virus ARN se distinguen de células cancerosas o células normales mediante la determinación del nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No 3. 16. Método de detección según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el cada una de dichas etapas de determinación comprende la identificación y cuantificación de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido mediante al menos uno de los procedimientos siguientes: hibridación in situ, hibridación fluorescente in situ, Northern blot, hibridación en gota, amplificación de ADNc mediante PCR, TMA o ensayo de protección de ribonucleasa. 17. Método de detección según una cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en el que dichas etapas de determinación se llevan a cabo en muestras humanas. 18. Método de detección según la reivindicación 17, en el que dichas muestras humanas comprenden una muestra seleccionada de cortes de tejido congelados o fijados de biopsias humanas, frotis citológicos o suspensiones de células en saliva, orina, sangre, médula ósea, colonocitos, lavado pulmonar, células metastásicas de sangre y linfa. 19. Compuestos u oligonucleótidos de 10 a 50 bases de longitud que son suficientemente complementarios a una molécula de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para poder hibridar con esa molécula de ARN quimérico mitocondrial humano para formar una pareja estable, para su uso como medicamento para el tratamiento del cáncer o precáncer. 20. Compuestos u oligonucleótidos según la reivindicación 19, en los que los compuestos u oligonucleótidos se seleccionan de SEQ ID NOS. 9-97. 21. Compuestos u oligonucleótidos según la reivindicación 19, en los que los compuestos u oligonucleótidos son oligonucleótidos de 15 a 50 bases de longitud en los que al menos 15 bases son complementarias a SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y/o SEQ ID No. 6. 22. Compuestos u oligonucleótidos según la reivindicación 21, en los que los oligonucleótidos tienen 18-50 bases de longitud. 23. Compuestos u oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en los que dicho medicamento puede inducir al menos una de muerte de células precancerosas y muerte de células cancerosas en células o tejidos. 24. Compuestos u oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en los que dicho medicamento está adaptado para la administración conjuntamente con una droga quimioterapéutica para el tratamiento del cáncer. 25. Kit para hibridación in situ útil para distinguir entre células en proliferación humanas normales y células humanas transformadas o malignas mediante el método de detección según la reivindicación 12, incluyendo el kit: 68 (a) uno o más oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19-24, en el que dichos oligonucleótidos se marcan para poder detectarse, (b) reactivo de anticuerpo conjugado para la detección del marcador, (e) tampón de hibridación y lavado, y ES 2 365 511 T3 (d) uno o más portaobjetos de células en proliferación humanas normales transformadas o fijadas y uno o más portaobjetos de células malignas o transformadas fijadas, como controles. 26. Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como blancos que tras interferencia inducen muerte de células cancerosas y precancerosas. 27. Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial según la reivindicación 26, en el que dicha interferencia se lleva a cabo mediante un material seleccionado de oligonucleótidos complementarios y ARN de interferencia pequeño. 28. Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como blancos para el diagnóstico de cáncer y precáncer mediante la distinción entre células normales y células cancerosas y precancerosas mediante: la determinación de un nivel de al menos uno de los ARNs mitocondriales antisentido humanos según las reivindicaciones 1-5, y la determinación de un nivel de un ARN mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1. 29. Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como blancos para el diagnóstico de cáncer y precáncer mediante la distinción entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células precancerosas y cancerosas mediante: la determinación de un nivel de al menos uno de los ARNs mitocondriales antisentido humanos según las reivindicaciones 1-5, y la determinación de un nivel de un ARN mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 2. 30. Uso de la molécula de ARN quimérico mitocondrial de SEQ ID No. 3 como blanco para distinguir células transformadas con virus ARN de células cancerosas o células normales mediante la determinación del nivel de ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 3. 69 ES 2 365 511 T3 ES 2 365 511 T3 71 ES 2 365 511 T3 72 ES 2 365 511 T3 SONDA PARA SONDA PARA EL ARN EL ARN QUIMERICO QUIMERICO SENTIDO ANTISENTIDO Fig. 4A 73 Células RAMOS Células MCF/7 Células Jurkat Células Melanoma Células DU145 ES 2 365 511 T3 SONDA PARA SONDA PARA EL ARN EL ARN QUIMERICO QUIMERICO SENTIDO ANTISENTIDO Fig. 4B. 74 Cáncer de glándula mamaria Cáncer de glándula mamaria Cáncer de vejiga Cáncer de pulmón Leucemia linfocítica Cáncer gástrico ES 2 365 511 T3 SONDA PARA SONDA PARA EL ARN EL ARN QUIMERICO QUIMERICO SENTIDO ANTISENTIDO Fig. 5A. ES 2 365 511 T3 SONDA PARA EL ARN QUIMERICO MITOCONDRIAL Cáncer de colon Cáncer de ovario Cáncer de próstata Hepatocarcinoma Cancinoma de tiroide Astrocitoma Linfoma de Hodgkin Linfoma Fig. 5B. 76 Testículo Embrión de ratón Bazo Queratinocitos humanos ES 2 365 511 T3 SONDA PARA SONDA PARA EL ARN EL ARN QUIMERICO QUIMERICO SENTIDO ANTISENTIDO Fig. 6. 77 PCNA Sonda para ARN quimérico sentido Sonda para ARN quimérico antisentido ES 2 365 511 T3 Linfocitos Linfocitos control con PHA Fig. 7. 78 Células HFK698 Células SiHa Células HeLa Tumor de glándula mamaria Rabdomiosarcoma ES 2 365 511 T3 Fig. 8 79 ES 2 365 511 T3 ES 2 365 511 T3 81