Levaduras vínicas recombinantes.Método de obtención de cepas que secretan una mayor concentración de manoproteínas al medio,

cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)¡ con el número CECT 13012, y usos de dichas cepas

Levaduras vínicas recombinantes.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular aplicada a la alimentación, de la ingeniería genética, y más específicamente en el campo de la enología. En concreto se refiere a levaduras vínicas recombinantes que estabilizan el vino frente a la quiebra proteica y secretan mayor cantidad de manoproteínas que las cepas no modificadas, así como su modo de obtención. Estas cepas permiten además mejorar la calidad del vino, gracias a su contribución al aumento en la concentración de manoproteínas, sin recurrir a la adición de preparados exógenos, permitiendo reducir el consumo de bentonita, con el consiguiente ahorro en producto, así como la reducción del impacto negativo de la bentonita en la complejidad sensorial del vino y en la recuperación volumétrica de vino tras el tratamiento.

Estado de la técnica anterior

La industria del vino tiene una gran importancia económica y social, ya no exclusivamente en las regiones de clima mediterráneo, sino que el sector vitivinícola ha alcanzado importancia mundial. Por tanto, el control de los procesos que tienen lugar en la viticultura, es fundamental para el desarrollo y expansión de esta industria.

Uno de los problemas que suele afectar a los vinos blancos y rosados, en la fase de fermentación, es la quiebra proteica. Se conoce como quiebra proteica el enturbiamiento ocasional de los vinos blancos y rosados que se produce por una floculación (reposo) de las proteínas naturales de la uva, debido a las altas temperaturas o el tiempo de almacenamiento. Esta turbidez puede ser apreciada por los consumidores como una alteración (Waters, E., Dupin, I. and Stockdale, V. 2000. A review of current knowledge on polysaccharides that protect against protein haze in white wine. Aust. Grapegrower Winemaker, 438a: 13-16).

Actualmente, el único sistema realmente eficaz para evitar la quiebra proteica es la eliminación de las proteínas inestables, lo que únicamente se puede conseguir con el tratamiento con bentonita o mediante ultrafiltración.

No obstante, la clarificación con bentonita es un proceso que afecta la calidad sensorial del vino. Al eliminar gran parte de las proteínas, el vino pierde estructura y untuosidad. Además la bentonita afecta seriamente el aroma del vino, ya que absorbe directamente aromas, o indirectamente ya que las proteínas son fijadores de aromas y al ser eliminadas del vino arrastran con ellas parte de estos aromas. Además, las proteínas son moléculas tensoactivas y se ha comprobado que son factores muy positivos para la espumabilidad y la persistencia de la espuma de los vinos espumosos. La alternativa de la ultrafiltración también afecta significativamente el aroma y la untuosidad del vino, además de que su implantación requiere llevar a cabo una inversión cuantiosa por parte de las bodegas.

El origen de las proteínas del vino es múltiple, ya que pueden proceder de la misma uva, de las levaduras por autolisis y de los productos de clarificación o de los coadyuvantes de tiraje de naturaleza proteica. Por ello, la fracción proteica de un vino estará condicionada entre otros por aspectos tales como la variedad vinífera, el grado de madurez, el sistema de vinificación, la cepa de levadura, el tiempo de contacto con las lías, la dosis y el tipo de clarificante empleado, y el en el caso de los vinos espumosos, por el tiempo de crianza y por el tipo y la dosis del coadyuvante de tiraje empleado.

Las proteínas fundamentalmente implicadas en la quiebra proteica son las procedentes de la uva, mientras que parece que las manoproteínas liberadas por las levaduras en la vinificación ejercen un efecto estabilizador frente a la misma, ya que actúan como coloides protectores e incrementan la estabilidad del vino. Por tanto, la cepa de levadura, que es uno de los factores que controlan la cantidad de manoproteínas liberadas durante la producción enológica, es un factor determinante de la quiebra proteica. Además las levaduras liberan constituyentes celulares, como proteínas o polisacáridos, que también contribuyen a la calidad del vino (Feuillat, M. 2003. Yeast macromolecules: Origin, Composition and Enological interest. Am J. Enol. Vitic. 54: 211-213). Otras propiedades enológicas de las manoproteínas son la protección frente a la inestabilidad tartárica, la retención de compuestos del aroma, la reducción de la astringencia, aumento de la sensación dulce, y aumento del cuerpo y redondez en boca, especialmente apreciados en vino tinto. Además, las manoproteínas estimulan el crecimiento de bacterias lácticas, y consecuentemente la fermentación maloláctica, y mejoran la calidad de la espuma de vinos espumosos.

Algunas proteínas concretas de la pared celular de la levadura se ha demostrado específicamente que son capaces de estabilizar el vino frente a quiebra proteica (Waters, E.J., Wallace, W., Tate, M.E. and Williams, P.J. 1993. Isolation and partial charachterization of a natural haze protective factor from wine. J. Agric. Food Chem. 41:724-730; Waters, E.J., Pellerin, P. and Brillouet, J.M. 1994. A Saccharomyces mannoprotein that protects wine from protein haze. Carbohydr. Polym. 23:185-191.). Brown y colaboradores (Brown et al. 2007. Reducing haziness in white wine by overexpression of Saccharomyces cerevisiae genes YOL155c and YDR055w. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:1363-1376) clonaron y sobreexpresaron en cepas de laboratorio de S. cerevisiae los genes YOL155c and YDR055w, que codifican respectivamente las proteínas Hpf1p y Hpf2p, y demostraron que la proteína Hpf2 así producida reducía la turbidez hasta un 40% cuando se añadía al vino. Sin embargo no existe ninguna cepa vínica recombinante que secrete más manoproteínas durante la fermentación alcohólica.

La estrategia general en ingeniería genética para sobreexpresar una determinada proteína es clonar el gen, o los genes, que codifican dicha proteína en el organismo de interés. Dicho gen o proteína de interés, comprendido en una secuencia polinucleotídica, es introducido en el organismo hospedador, generalmente mediante un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc... Existen numerosos ejemplos, como la solicitud de patente WO/2003/04037, o la patente estadounidense US 6,274,311.

En resultados previos con cepas de laboratorio, se ha demostrado que, no la inserción, sino la deleción de los genes FKS1, GPI7, GAS1 ó KNR4 (aunque en este contexto no es muy importante sería más correcto poner en itálica los nombres de los genes, pero no de las proteínas, a lo largo de todo el texto, los he señalado en azul), daba lugar a un incremento en la liberación de manoproteínas en medios de cultivo (González-Ramos, D. and González, R. 2006. Genetic determinants of the release of mannoproteins of enological interest by Saccharomyces cerevisiae. J. Agric. Food Chem. 54:9411-9416). Este fenotipo es recesivo y depende del fondo genético. El sobrenadante de las cepas que carecen de todas las copias de los genes correspondientes es más rico en manoproteínas que el de las cepas control, ya desde el inicio de la fase estacionaria. Cuando se añaden exógenamente a un vino, los polisacáridos aislados de estos sobrenadantes permiten mejorar la estabilidad proteica de los vinos acabados, de acuerdo con el contenido relativo en manoproteínas de cada uno.

Descripción de la invención

Existe la necesidad de obtener vinos de elevada estabilidad frente a la quiebra proteica y que conserve las cualidades organolépticas óptimas, no mermando la calidad de los mismos mediante la adición en elevadas cantidades de otros componentes, como la bentonita. Las manoproteínas liberadas por las levaduras en la vinificación actúan como coloides protectores e incrementan la estabilidad del vino, ejerciendo un efecto estabilizador frente a la quiebra proteica, además de mejorar algunas cualidades organolépticas del vino resultante.

A pesar de los resultados previos obtenidos en cepas de laboratorio, la mejora genética...

1. Método para obtener cepas de levadura recombinantes industriales, que aumentan la concentración de manoproteínas secretadas al medio, que comprende delecionar en un fondo genético de cepas de levadura genes relacionados con la biogénesis de la pared celular o la liberación de proteínas.

2. Método según la reivindicación anterior, en el que las cepas pertenecen al género Saccharomyces.

3. Método según la reivindicación anterior, en el que las cepas pertenecen a la especie Saccharomyces cerevisiae.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el gen delecionado se selecciona de una lista que comprende: