Procedimiento para producir e identificar mutaciones en la región estructural que mejora la unión de anticuerpos humanizados con sus antígenos afines,

comprendiendo el método: (a) injertar regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en una región estructural humana que comprende VLκ subgrupo I (VLκI) y VH subgrupo III (VHIII); (b) mutagenizar aleatoriamente residuos de la región estructural de un grupo de trece posiciones críticas de la región estructural; (c) expresar de forma monovalente la biblioteca resultante de moléculas de anticuerpo en la superficie del fago filamentoso; (d) identificar las secuencias óptimas de la región estructural mediante selección basada en afinidad; y (e) opcionalmente mutar adicionalmente anticuerpos seleccionados mediante la sustitución de residuos vernier que se sitúan en el interfaz VL-VH por residuos que se emparejan con el anticuerpo parental no humano, donde los residuos críticos de la región estructural de la etapa (b) son los residuos 4 y 71 de VL y los residuos 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 (numeración de Kabat) de VH

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a procedimientos para preparar anticuerpos humanos. En particular, la presente invención está dirigida a procedimientos para preparar anticuerpos humanizados usando un sistema de presentación en fagos monovalente y de mutantes de anticuerpos producidos por mutagénesis aleatoria de un pequeño grupo de residuos estructurales críticos realizados en una sola región estructural humana. Más particularmente, esta invención está dirigida a la humanización de un anticuerpo murino que se une al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) tienen un potencial enorme como agentes terapéuticos, particularmente cuando se usan para regular sistemas definidos. Por ejemplo, en algunas circunstancias se podría desear regular un sistema, como por ejemplo la angiogénesis, en la que se forman vasos capilares nuevos a partir de las paredes de los vasos pequeños existentes. La angiogénesis generalmente es importante después de la aparición de una herida o de una infección ya que en los tejidos adyacentes a la lesión se puede estimular la inducción de crecimiento capilar. Sin embargo, la angiogénesis también es importante en el crecimiento tumoral, ya que, para un crecimiento continuado, un tumor debe inducir la formación de una red capilar que invada la masa tumoral.

Se han identificado determinados factores de crecimiento que regulan la angiogénesis. De particular interés es el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), que parece ser el agente por el cual algunos tumores adquieren su gran irrigación sanguínea. Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed., Alberts et al., Garland Publishing, págs. 1154 (1994). Por lo tanto, los mAbs anti VEGF, por ejemplo, pueden ser útiles por un variedad de razones, incluyendo su uso en la regulación de la angiogénesis y más particularmente, como un agente antitumoral. Previamente se ha descrito un mAB A4.6.1 murino anti VEGF que bloquea la unión al receptor de VEGF. Se ha demostrado que este anticuerpo inhibe la señalización mitogénica. Kim y col., Growth Factors 7, 53 (1992); Kim y col., Nature 362, 841 (1993).

La mayoría de mABs incluyendo el anti VEGF descrito anteriormente tienen un origen murino y otras fuentes no humanas, lo que limita la eficacia clínica. En particular, el cuerpo a menudo reacciona con una respuesta inmunogénica frente a los anticuerpos no humanos, en la que se elimina rápidamente el anticuerpo del sistema antes de que se produzca su efecto terapéutico. Además de la inmunogenicidad de los mAbs no humanos, que aparece cuando se administran a humanos, existen limitaciones adicionales debidas a la débil incorporación de función efectora.

Para sortear estas deficiencias, se pueden conferir las propiedades de unión antigénica de los mAbs no humanos a los anticuerpos humanos a través de un procedimiento conocido como “humanización” del anticuerpo. Un anticuerpo humanizado contiene la secuencia aminoacídica de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) (el centro de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo) del mAb no humano parental o correspondiente, injertado en la región estructural de un anticuerpo humano. Por lo tanto, la humanización de anticuerpos no humanos se conoce generalmente como injertos de CDR. El bajo contenido de secuencia no humana en tales anticuerpos humanizados (~5%) tiene una eficacia demostrada en la reducción de la inmunogenicidad y en la prolongación de la vida media sérica de los anticuerpos administrados a los humanos. Entre otros, los anticuerpos monoclonales humanizados (“inmunoglobulinas quiméricas”) se describen en la patente de EE.UU. Nº 4.816.567.

Desafortunadamente, la simple inserción de secuencias de CDR a menudo produce anticuerpos humanizados que se unen al antígeno de modo mucho más débil que el mAb parental no humano. Para restaurar la alta afinidad de unión, el anticuerpo debe atravesar procesos adicionales para ajustar la estructura de las hélices de unión al antígeno. Esto se logra reemplazando residuos clave en las regiones estructurales del los dominios variables del anticuerpo con la secuencia que encaje con la del anticuerpo murino parental. Estos residuos estructurales normalmente están implicados en el mantenimiento de la conformación de las hélices de CDR, aunque algunos residuos estructurales pueden contactar directamente con el antígeno. Se han realizado estudios que han evidenciado la importancia de determinados residuos estructurales para la conformación de las CDR y se ha recopilado una exhaustiva lista de todos los residuos estructurales que puedan afectar a la unión al antígeno.

**(Ver fórmula)**

Chothia et al., J. Mol. Biol. 224, 487 (1992); Foote et al., J. Mol. Biol. 224, 489 (1992). La lista exhaustiva incluye unos treinta residuos “vernier” que pueden potencialmente contribuir a la estructura de las CDR. Aunque probablemente se produciría una mayor afinidad de unión al antígeno al cambiar todo el conjunto de residuos vernier de un anticuerpo humanizado de modo que encajara con la secuencia no humana parental correspondiente, esto no sería generalmente deseable debido a un aumento del riesgo de inmunogenicidad impuesta al añadir elementos adicionales de secuencia no humana. Así, desde un punto de vista terapéutico, es preferible limitar los cambios estructurales a un conjunto mínimo para obtener un anticuerpo humanizado de alta afinidad.

Por lo tanto, es deseable identificar un pequeño grupo de cambios que sean suficientes para optimizar la unión, sin embargo, se espera que los cambios requeridos difieran de un anticuerpo humanizado a otro. Para lograr el resultado deseado, un enfoque ha sido identificar la combinación adecuada de mutaciones construyendo un panel de mutaciones que tengan residuos estructurales “candidatos” reemplazados por sus homólogos murinos. Estas variantes se forman individualmente y se prueban con antígenos y después se combinan con otras variantes que tienen afinidades de unión favorables. Sin embargo, este procedimiento implica ciclos de mutagénesis dirigida individual, aislamiento y análisis y por lo tanto no es deseable ya que es una labor muy costosa y tediosa.

Para simplificar la humanización de anticuerpos, se han desarrollado varios enfoques diferentes. Véase, por ejemplo, Queen y col., PNASUSA 86, 10029(1989); Kettleborough et al., Protein Eng. 4,773(1991); Tempest et al., Biotechnology 9, 266 (1991); Padlan, Mol. Immunol. 28, 489 (1991); Roguska et al., PNAS USA 91, 969 (1994); Studnicka et al., Protein Eng. 7, 805 (1994); Allen et al., J. Immunol. 135, 368 (1985); Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18, 49 (1994); Shalaby et al., J.Exp. Med. 175, 217 (1992); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th), Public Health Service,NIH, Bethesda, MD (1991); Rosok et al., J. Biol. Chem. 271, 22611 (1996); WO-A-92/22653, GB-A-2 268 744, y WO 94/04679. El documento WO-A-92/22653 incluye una lista de sitios de mutación preferentes. Es un objeto de la presente invención el proporcionar medios generales para seleccionar rápidamente mutaciones estructurales que mejoren la unión de anticuerpos humanizados a sus antígenos cognados en donde se eliminan los procedimientos actuales de optimización estructural basados en ciclos de mutagénesis dirigida individual y análisis.

Es además un objeto el proporcionar procedimientos rápidos de anticuerpos humanizantes que proporcionen anticuerpos con una baja inmunogenicidad y que utilicen una sola región estructural como respaldo.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

El anticuerpo humanizado inicial anti VEGF tiene una región estructural que deriva de secuencias de consenso para las subclases humanas más abundantes, a saber, Vκ subgrupo I (VκI) y Vsubgrupo III (VIII) en

LIH H

las que se injertan CDR de anticuerpos no humanos anti VEGF. La mutagénesis aleatoria de los residuos estructurales críticos en la construcción inicial produjo el anticuerpo humanizado anti VEGF descrito en la presente memoria descriptiva que tiene una afinidad por el antígeno 125 veces mayor en relación con el anticuerpo humanizado inicial sin cambios estructurales. Una sola mutación adicional produjo una mejora de seis veces en la unión. Este anticuerpo anti VEGF humanizado se puede reproducir por el procedimiento descrito en la presente memoria... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir e identificar mutaciones en la región estructural que mejora la unión de anticuerpos humanizados con sus antígenos afines, comprendiendo el método:

(a) injertar regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en una región estructural humana que comprende VLκ subgrupo I (VLκI) y VH subgrupo III (VHIII);

(b) mutagenizar aleatoriamente residuos de la región estructural de un grupo de trece posiciones críticas de la región estructural;

(c) expresar de forma monovalente la biblioteca resultante de moléculas de anticuerpo en la superficie del fago filamentoso;

(d) identificar las secuencias óptimas de la región estructural mediante selección basada en afinidad; y

(e) opcionalmente mutar adicionalmente anticuerpos seleccionados mediante la sustitución de residuos vernier que se sitúan en el interfaz VL-VH por residuos que se emparejan con el anticuerpo parental no humano,

donde los residuos críticos de la región estructural de la etapa (b) son los residuos 4 y 71 de VL y los residuos 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 (numeración de Kabat) de VH.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los residuos críticos de la región estructural son parcialmente aleatorios para permitir la selección de una secuencia de la región estructural murina, la secuencia de la región estructural consenso VLκI-VHIII humana, o las secuencias de la región estructural halladas generalmente en otras regiones estructurales humanas y murinas.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo humanizado es un anticuerpo anti-VEGF.