Procedimiento para la obtención de levaduras vínicas superproductoras de manoproteínas mediante tecnologías no recombinantes.

Procedimiento para obtener cepas de levaduras superproductoras de manoproteínas mediante la selección de mutantes resistentes a la toxina K9, cepas obtenibles por dicho procedimiento y usos

Procedimiento para la obtención de levaduras vínicas superproductoras de manoproteínas mediante tecnologías no recombinantes.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la mejora genética de microorganismos aplicada a la alimentación, y más específicamente en el campo de la enología. En concreto se refiere a un método para la obtención de levaduras vínicas mejoradas que secretan mayor cantidad de manoproteínas que las cepas originales, sin necesidad de utilizar técnicas de ingeniería genética. El método se basa en la obtención de mutantes al azar combinado con un método novedoso de selección de los mutantes que permite indirectamente la selección de las cepas que secretan más manoproteínas, sin necesidad de utilizar métodos poco eficientes para la selección directa de esta característica.

Estado de la técnica anterior

La industria del vino tiene una gran importancia económica y social, ya no exclusivamente en las regiones de clima mediterráneo, sino que el sector vitivinícola ha alcanzado importancia mundial. Por tanto, el control de los procesos que tienen lugar en la viticultura y la enología, es fundamental para el desarrollo y expansión de esta industria.

Las manoproteínas de la pared celular de S. cerevisiae tienen un enorme interés en enología debido a su contribución positiva a la calidad de todo tipo de vinos (blancos, rosados, tintos y espumosos) a través de su influencia en numerosos aspectos sensoriales y tecnológicos (Candi, A. 2006. Antonie van Leeuwenhoek, 89: 417-422).

La estabilización química de los vinos blancos fue una de las primeras propiedades enológicas descritas para las manoproteínas. Así los vinos enriquecidos en manoproteínas mediante la crianza sobre lías o mediante adición directa son más estables frente a quiebra proteica (Waters et al., 2000. Aust. Grapegrower Winemaker, 438a: 13-16; Ledoux et al., 1992. J. Int. Sci. Vigne Vin. 26 : 239-251) y tartárica (Feuillat et al., 1998. Bull. O.I.V. 71: (813-814), 945-967).

De manera aún más interesante, la riqueza en manoproteínas del vino se correlaciona con propiedades relacionadas con la calidad sensorial, tales como: (1) la retención de compuestos del aroma (Lubbers et al., 1994. Debensm.-Wiss.u.-Technol. 27: 108-114; Wolz, S. 2005. Deutsche Weinmagazin 22: 21-25); (2) la reducción de la astringencia (Escot et al., 2001. Aust J Grape Wine Res. 7 (3): 153-159); (3) el aumento del cuerpo y redondez en boca (Wolz, S. 2005. Deutsche Weinmagazin. 22: 21-25; Vidal et al., 2004. Food Chem. 85 (4):519-525; Saucier et al., 1999. Revue des Oenologues et des Techniques Vitivinicoles et OEnologiques 94: 9-10), características especialmente apreciadas en los vinos tintos junto con (4) el color, a cuya estabilidad también contribuyen la manoproteínas (Escot et al., 2001. Aust. J. Grape Wine Res. 7:153-159).

Por último las manoproteínas parecen (5) estimular el crecimiento de las bacterias lácticas y consecuentemente la fermentación maloláctica (Rosi et al., 1999. Revue des Oenologues et des Techniques Vitivinicoles et OEnologiques. 94 : 18-20; Guilloux-Benattier et al., 1995. Am J. Enol. Vitic. 46 (4): 486-492), así como (6) mejorar la calidad de la espuma de los vinos espumosos (Feuillat, M. 1987. Revue Française d'OEnologie. 109:17-27; Feuillat, M. 2003, Am J. Enol. Vitic. 54(3): 211-213).

La cepa concreta de levadura es uno de los factores más importantes responsables de la cantidad de manoproteínas presentes en el vino al final del proceso de elaboración. Existe por lo tanto un interés creciente por el desarrollo de cepas de levaduras que liberen mayores cantidades de manoproteínas que las actualmente disponibles, o simplemente por mejorar la liberación de manoproteínas en cepas con otras propiedades enológicas positivas ya contrastadas (cepas comerciales). La mejora genética clásica, y en concreto la mejora de cepas de levadura mediante mutagénesis al azar, es una herramienta potencial mente interesante para la mejora genética de cepas de levadura vínica (Cebollero et al., 2007. Biotechnol. Lett. 29: 191-200). La mejora genética de cepas vínicas ya seleccionadas, y con utilidad enológica contrastada, tiene la ventaja sobre la selección de cepas directamente de la naturaleza de que todas estas propiedades ya están comprobadas y se trata simplemente de introducir una nueva características que haga más interesante la cepa en cuestión.

Sin embargo los métodos clásicos de mejora genética, y en particular la mutagénesis al azar, encuentran importantes limitaciones cuando no existe un procedimiento sencillo de selección de los mutantes deseados. Esto ocurre por ejemplo para caracteres cuantitativos (como la producción de etanol, glicerol u otros metabolitos), y especialmente cuando son difíciles de medir, como la producción de manoproteínas. En este contexto, disponer de un sistema de selección que permita identificar fácilmente los clones de interés, aunque sea de manera indirecta, constituye una ventaja sin la cual es casi imposible abordar estos procesos de mejora genética. Un incremento en la liberación de manoproteínas de un 50%, siendo tecnológicamente muy relevante, es muy difícil de detectar directamente mediante un análisis sencillo en placa con el estado de la técnica previo a la presente invención.

La aplicación de métodos clásicos de mejora genética a la obtención de cepas de levadura con una capacidad incrementada de secreción de manoproteínas se enfrenta con el problema de que la cuantificación de manoproteínas es compleja, y además no existen métodos en placa para diferenciar las colonias de levadura en función de su capacidad de liberar manoproteínas. Dado que en estos experimentos la frecuencia esperada de mutaciones que den lugar a un incremento en la liberación de manoproteínas es baja, la obtención de mutantes supersecretores de manoproteínas a partir de una cepa industrial de interés era prácticamente imposible utilizando los métodos hasta ahora disponibles.

Aunque existen métodos para obtener cepas supersecretoras de manoproteínas (González-Ramos et al., 2008. Appl. Environ. Microbiol. en prensa), dichos métodos dan lugar a microorganismos recombinantes, cuya utilidad industrial está actualmente impedida por las restricciones legales a su utilización y etiquetado, contenidas en normativas europeas y estatales, así como en el ámbito específico de la enología las limitaciones impuestas por la OIV y los Consejos Reguladores de las D.O.

Descripción de la invención

Existe una necesidad de obtener levaduras vínicas que produzcan durante la fermentación mayores cantidades de manoproteínas que las cepas actualmente disponibles. Estas manoproteínas contribuyen de manera positiva a la calidad de todos los tipos de vino, mediante la retención de compuestos del aroma, estabilización del color (vinos tintos), reducción de la astringencia, aumento del cuerpo y redondez en boca, estimulación de la fermentación maloláctica, y estabilidad y calidad de la espuma (de los vinos espumosos).

Los autores de la presente invención han desarrollado un método de selección que permite llevar a cabo un cribado previo, mediante el fenotipo en placa, de los mutantes con mayor potencial de liberación de manoproteínas. De esta manera, en un experimento de mutagénesis clásica, se consiguen rápidamente mutantes que liberan más manoproteínas que la cepa original. Por tanto, el procedimiento de la invención permite identificar, en un experimento de mutagénesis al azar, en presencia de un número elevado de células, mutantes que liberan mayores cantidades de manoproteínas que la cepa original mediante selección visual directa en placa.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para obtener cepas de levadura superproductoras de manoproteínas (de aquí en adelante método de la invención) que comprende:

1. Procedimiento para obtener cepas de levaduras superproductoras de manoproteínas que comprende: