PROCEDIMIENTO PARA LA INTEGRACIÓN CROMOSÓMICA Y SUSTITUCIÓN DE LA SECUENCIA DE ADN EN CLOSTRIDIA.

Procedimiento para la integración cromosómica y sustitución de la secuencia de ADN en clostridia. Antecedentes de la invención Clostridia son bacterias gram positivas, anaeróbicas y bajas en GC que se utilizan ampliamente en la industria por sus capacidades para producir disolventes, en particular butanol, etanol y acetona, pero también dioles como 1,3propanodiol, ácidos orgánicos como ácido acético, butílico o láctico y vacunas. La construcción de Clostridia recombinante es una parte importante del desarrollo en este campo. Las cepas de Clostridium están modificadas genéticamente para mejorar sus capacidades industriales. Para realizar estas modificaciones, la recombinación homóloga es la técnica más utilizada en todo tipo de organismos. La transformación, transposición y recombinación homóloga en varios microorganismos se ha descrito extensamente en esta materia. Véase por ejemplo (Datsenko y Wanner; PNAS, 2000) (Fabret et al., Molecular Microbiology, 2002) y el documento WO 01/71040 (Dupont de Nemours). Clostridia no se pueden transformar de forma natural y los procedimientos actualmente disponibles para su transformación son ineficaces y no permiten la introducción de múltiples mutaciones. Esto ha impedido desarrollos industriales en este campo. Clostridia producen normalmente ADNasas extracelulares y enzimas de restricción que degradan el ADN extraño antes y después de la introducción en las células para transformación. Los procedimientos clásicos basados en la introducción de fragmentos de RCP que actúan bien en muchos microorganismos tal como E. coli o levadura, no son fiables en estos organismos, ya que la vida media extracelular e intracelular del montaje de ADN para recombinarse es demasiado corto y la eficacia de recombinación es generalmente baja. En otros organismos estas dificultades se han resuelto utilizando vectores que se duplican en el hospedador aumentando de este modo la probabilidad del episodio de recombinación. No obstante después del episodio de recombinación ha de eliminarse el vector que lleva ahora la secuencia de ADN diana intacta. Este problema se solucionó en Lactococcus lactis (Biswas et al., J.Bacteriol., 1993) utilizando replicones sensibles a la temperatura que pueden eliminarse a la temperatura no permisiva. Actualmente no hay ningún vector disponible con estas características para Clostridia. Por consiguiente la construcción de mutantes en Clostridia ha sido hasta ahora muy laboriosa y con frecuencia sin éxito. La inactivación de genes en Clostridia se publicó en los artículos siguientes (véase Tabla 1). Tabla 1 Cepa Genotipo Referencia PJC4BK de Clostridium acetobutylicum buk-, MLS R Green et al., 1996 PJC4PTA de Clostridium acetobutylicum pta-, MLS R Green et al., 1996 PJC4AAD de Clostridium acetobutylicum aad-, MLS R Green y Bennett, 1996 SM101 y F4969 de Clostridium perfringens cpe, CatP Saarker et al., 1999 Cepa 13 de Clostridium perfringens luxS Ohtani et al., 2002 SKO1 de Clostridium acetobutylicum spoA, MLS P Harris et al., 2002 Tipo A de Clostridium perfringens spo0A Huang et al., 2004 SM101 de Clostridium perfringens ccpA-, CatP Varga et al., 2004 ATCC 824 buk de Clostridium acetobutylicum SpollE, buk-, CatP WO 2006/007530 La inactivación génica se ha realizado hasta ahora en Clostridia transformando con ADN circular que no podía duplicarse en las cepas diana. Ya que las ADNasas y las endonucleasas de restricción de ADN presentes en Clostridia degradan rápidamente el ADN introducido, y generalmente la frecuencia de recombinación en este género no es muy elevada, ha sido muy laboriosa la obtención de mutantes. Además, las cepas recombinantes descritas hasta ahora (véase anteriormente) son todas resistentes a MLS o a cloranfenicol y los correspondientes genes marcadores no pueden eliminarse después que se ha producido el episodio de recombinación. Esto limita el número de posibles recombinaciones al número de marcadores de resistencia disponibles en estas bacterias a un máximo de 3. Además, para la utilización industrial de estas bacterias, podría ser útil tener cepas sin marcadores a fin de impedir la liberación de genes con resistencia a los antibióticos en los medios de fermentación. Por otra parte, algunas de estas cepas que se han obtenido por episodios de recombinación individuales adolecen el inconveniente de que no son estables si se cultivan sin presión de selección alguna. Por consiguiente, todavía existe la necesidad en la situación actual de la tecnología de un procedimiento para la 2   transformación de Clostridia con gran eficacia, con una fácil etapa de selección de cepas recombinantes, que permite las sustituciones sucesivas de la secuencia de ADN en la misma cepa, conduciendo a Clostridia recombinantes que son genéticamente estables y sin marcadores. La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para reemplazar o eliminar secuencias de ADN en Clostridia, fácil de realizar y aplicable a nivel industrial. Este procedimiento es útil para modificar varios locus genéticos en Clostridia de manera rutinaria. Este procedimiento se basa en un vector duplicado útil para la transformación de Clostridia con gran eficacia. Con este nuevo procedimiento, puede introducirse en el genoma un número ilimitado de mutaciones, eliminando los casetes con resistencia del genoma y reutilizándolos en sucesivas rondas de sustitución de la secuencia de ADN. La introducción eficaz de múltiples mutaciones en Clostridia permitiría a la industria mejorar las cepas industriales existentes y desarrollar nuevos procedimientos. Descripción de la invención La presente invención proporciona un procedimiento para la sustitución de una secuencia de ADN diana mediante recombinación homóloga en Clostridia, que comprende: - Transformar dicha cepa con un vector que comprende: - un origen de replicación que permite su replicación en Clostridia y - un casete de sustitución que comprende un primer gen marcador rodeado de dos secuencias homólogas a las regiones seleccionadas alrededor de la secuencia de ADN diana, permitiendo la recombinación del casete, y - un segundo gen marcador, - seleccionar las cepas que tienen integrada en su genoma dicho casete, que expresan el primer gen marcador, - seleccionar las cepas que han eliminado dicho vector, que no expresan el segundo gen marcador, en la que el segundo gen marcador es un marcador de contraselección. Todas las técnicas de biología molecular utilizadas para realizar la invención están completamente descritas en Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, de Sambrook, Fritsch y Maniatis. El término sustitución de una secuencia de ADN diana utilizado en el contexto de la presente invención, significa que una secuencia diferente de la original se introduce en el locus de la secuencia de ADN diana. Según la invención, una secuencia de ADN se define como una secuencia génica o intergénica. Ambas pueden comprender secuencias activadoras o reguladoras. La expresión secuencia de ADN diana significa cualquier zona génica o intergénica, secuencia activadora o reguladora de interés seleccionada por un experto en la materia. Significa en particular genes que codifican proteínas de interés, por ejemplo enzimas implicadas en el metabolismo celular. La secuencia de ADN sustituida/insertada puede ser codificadora o no. Puede ser una secuencia mutada del gen diana, una secuencia activadora o reguladora y/o un marcador tal como un gen con resistencia a los antibióticos o una enzima generadora de color. Puede ser más larga o más corta que la secuencia sustituida, dependiendo de la distancia que separa las dos zonas homólogas. Debido a la inserción, la expresión del gen diana está normalmente perturbada, parcial o completamente suprimida o aumentada. La sustitución de la secuencia del ADN diana por una secuencia próxima a la original, pero que comprende mutaciones, conduce a la expresión existente de una proteína, secuencia activadora o reguladora mutadas. Si la sustitución de la secuencia de ADN diana da como resultado una eliminación total de dicha secuencia de ADN, el gen se califica como eliminado. La expresión recombinación homóloga se refiere al episodio de sustitución de un segmento de ADN por otro que posee zonas idénticas (homólogas) o casi idénticas. Este episodio se denomina también entrecruzamiento de ADN. 3   El término transformación se refiere a la incorporación de ácido nucleico exógeno por una célula, esta adquisición de nuevos genes que es transitoria, (si el vector que lleva los genes está curado) o permanente (en el caso de que el gen exógeno esté integrado en los cromosomas). El término vector se refiere a un elemento extracromosómico que lleva genes o casetes, que normalmente está en forma de moléculas de ADN bicatenario circular, pero... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la sustitución de una secuencia de ADN diana mediante recombinación homóloga en Clostridia, que comprende: - transformar dicha cepa con un vector que comprende: - un origen de replicación que permite su replicación en Clostridia y - un casete de sustitución que comprende un primer gen marcador rodeado de dos secuencias homólogas a las regiones seleccionadas alrededor de la secuencia de ADN diana, permitiendo la recombinación del casete, y - un segundo gen marcador, - seleccionar las cepas que tienen integrado en su genoma dicho casete, que expresan el primer gen marcador, - seleccionar las cepas que han eliminado dicho vector, que no expresan el segundo gen marcador, en el que el segundo gen marcador es un marcador de contraselección. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el marcador de contraselección es un gen que restablece la actividad de un gen ausente o eliminado no esencial. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el marcador de contraselección es el gen upp. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector comprende un tercer marcador que permite una selección negativa de cepas que han eliminado dicho vector. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector se elimina por digestión con endonucleasas. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el vector contiene secuencias de ADN que son reconocidas por endonucleasas de restricción y que están al mismo tiempo ausentes del genoma de la cepa de Clostridium utilizada. 7. Procedimiento según las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la cepa de Clostridium utilizada contiene en su genoma por lo menos una endonucleasa, específica para los sitios de restricción presentes en el vector, opcionalmente expresada bajo el control de un activador inducible. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gen marcador es un gen con resistencia a los antibióticos. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer gen marcador está rodeado por dos sitios diana de recombinasa. 10. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el primer gen marcador se elimina por la acción de una recombinasa una vez se ha producido el episodio de recombinación homóloga. 11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicha recombinasa es expresada por un gen transportado por un segundo vector introducido en la cepa. 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dichos sitios diana de recombinasa son secuencias FRT, y dicha recombinasa es la FLP recombinasa. 13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichas secuencias homólogas a regiones alrededor de la secuencia de ADN diana comprenden mutaciones hasta en el 10% de los pares de bases utilizados en el episodio de recombinación. 14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que las Clostridia que van a transformarse son eliminadas por genes que codifican la endonucleasa de restricción y/o por genes que codifican la ADNasa. 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las Clostridia que van a transformarse son eliminadas por el gen upp. 16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las cepas de Clostridia se seleccionan 18   de entre Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostrididum butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridirum saccharolyticum (actualmente, Thermoanaerobacter saccharolyticum), Costridium thermosulfurogenes (actualmente, Thermoanaerobacter thermosulfurigenes), Clostridium thermohydrosulfuricum (actualmente Thermoanaerobacter ethanolicus). 17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la cepa de Clostridium es Clostridium acetobutylicum y la cepa es cac15 y/o upp. 18. Procedimiento para sustitución de dos o más genes diana por recombinación homóloga en una misma cepa de Clostridium, en el que el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 se lleva a cabo sucesivamente dos o más veces. 19. Vector de transformación para la sustitución de una secuencia de ADN diana por recombinación homóloga en Clostridia, que comprende: - un origen de replicación que permite su replicación en Clostridia, y - un casete de sustitución que comprende un primer gen marcador rodeado por dos secuencias homólogas a las regiones seleccionadas alrededor de la secuencia de ADN diana, permitiendo la recombinación del casete, y - un segundo gen marcador, en el que el segundo gen marcador es un marcador de contraselección. 20. Vector según la reivindicación 19, en el que el marcador de contraselección es un gen que restablece la actividad de un gen ausente o eliminado no esencial. 21. Vector según la reivindicación 20, en el que el marcador de contraselección es el gen upp. 22. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que el vector comprende un tercer marcador que permite una selección negativa de cepas que han eliminado dicho vector. 23. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el vector alberga secuencias de ADN que son reconocidas por endonucleasas de restricción y que al mismo tiempo están ausentes del genoma de la cepa de Clostridium utilizada. 24. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en el que el primer gen marcador es un gen con resistencia a los antibióticos. 25. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que el primer gen marcador está rodeado por dos sitios diana de recombinasa. 26. Vector según la reivindicación 25, en el que dichos sitios diana de recombinasa son secuencias FRT, y dicha recombinasa es la FLP recombinasa. 19     21   22   23