Se describe una proteína con capacidad de unirse e inhibir la enzima uracil DNA glicosilasa (UDG) viral y su empleo como agente terapéutico,

en particular, como agente antiviral

Esta invención se refiere a una proteína que inhibe la enzima uracilo ADN glicosilasa (UDG) vírica, para su uso como un agente terapéutico, en particular como un agente antivírico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las infecciones víricas en personas y en animales, en especial en personas, están ampliamente extendidas y plantean numerosos problemas para los trabajadores sanitarios. Los agentes farmacéuticos capaces de luchar de forma eficaz y específica contra los virus son muy limitados en número y, además, en general producen efectos secundarios indeseables. Las infecciones víricas no sólo destruyen las células del huésped, sino que también afectan al funcionamiento de diferentes proteínas y enzimas. La invasión vírica favorece la infección por otros agentes patógenos, tales como otros virus, bacterias, hongos, etc. Así por ejemplo, debido a la pérdida inmunitaria que produce, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) abre la puerta a otros virus (herpes simplex, citomegalovirus, virus de la hepatitis B) y otros agentes patógenos que invaden el cuerpo humano, creando situaciones peligrosas.

A pesar de los intensos esfuerzos, hasta ahora no ha sido posible encontrar agentes quimioterapéuticos que interfieran, con un éxito esencialmente reconocible, en la causa o en los síntomas, con los episodios patógenos causados por agentes víricos. Por lo tanto, el tratamiento de enfermedades víricas mediante agentes quimioterapéuticos todavía está incompleto.

Los conjugados de anticuerpos, formados por un anticuerpo monoclonal conjugado o híbrido y una toxina, se han usado para erradicar colonias específicas de células diana, dirigiéndolos contra las células diana “indeseadas” que llevan antígenos de superficie diana y destruyéndolas. Las diferentes toxinas que han usado diferentes investigadores se pueden clasificar ampliamente en dos grupos. El primer grupo consiste en toxinas intactas, tales como la ricina intacta. Estas toxinas no se pueden aplicar de forma segura in vivo debido a su toxicidad letal. Las toxinas del segundo grupo se llaman hemitoxinas. Las hemitoxinas son proteínas inactivadoras de ribosomas de una sola cadena que actúan de forma catalítica en ribosomas de eucariotas e inactivan la subunidad 60S, conduciendo a una inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de proteínas celulares a nivel de la elongación del péptido.

Una hemitoxina de interés es la proteína antivírica de la hierba carmín (PAP), que se aísla de Phytolacca americana. Durante muchos años, se ha reconocido que la PAP tiene actividad antivírica. Se ha demostrado que la PAP bloquea la transmisión de los virus que contienen ARN en plantas. También se ha descrito que la PAP inhibe la replicación de dos virus animales que contienen ARN: el poliovirus y el virus influenza, y que la PAP inhibe la multiplicación de los virus del herpes simple de tipo I y tipo II (patente de US 4.672.053). Aunque se ha descrito que los conjugados de anticuerpo monoclonal de PAP G3.7/CD7, F13/CD14 y B43/CD19 inhiben la replicación del VIH-1, estos conjugados han resultado ser inconsistentes en su capacidad para inhibir la replicación de los virus.

En vista de lo anterior, sigue siendo necesario proporcionar nuevos compuestos o fármacos antivíricos. Ventajosamente, éstos nuevos agentes antivíricos deben presentar una eficacia que sea igual

o mayor que los agentes antivíricos descritos en el estado de la técnica y no deben producir efectos secundarios indeseables.

La mayoría de las células procariotas y eucariotas codifican la enzima uracilo ADN glicosilasa (UDG). La función de esta enzima es eliminar los restos de uracilo que aparecen en el ADN debido a la desaminación de la citosina o a la incorporación incorrecta de dUMP durante el proceso de replicación. Por ejemplo, si se produce la desaminación de la citosina y no se repara, se producirá una mutación de transición de C a T en la cadena de ADN en la que se ha producido dicha desaminación y, por consiguiente, tendrá lugar una mutación de transición de G a A en la cadena complementaria después del siguiente ciclo de replicación. Una vez que el uracilo es eliminado por la enzima UDG, se crea un sitio apurínico o apirimidínico (sitio AP). El mecanismo encargado de reparar estos sitios AP es la ruta de reparación de corte y empalme de bases.

En células humanas se han identificado hasta 5 enzimas diferentes con actividad de UDG. Curiosamente, una de estas enzimas, llamada UNG2, está presente en las partículas del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1). Además, algunos virus de ADN, tales como los herpesvirus y poxvirus, codifican su propia actividad de UDG. Como resultado de la capacidad de la enzima UDG para influir en la replicación vírica de diferentes herpesvirus, dicha enzima se ha asociado con el mecanismo de replicación vírica en la célula huésped. En los virus mencionados antes, se sabe que la enzima UDG es esencial para el proceso infectivo. Se ha propuesto que la función de esta enzima en los procesos de replicación vírica está asociada con la capacidad de esos virus para replicarse en células que no se dividen, en las que se considera que los niveles de la enzima UDG celular son bajos (Priet y col. (2005) Mol. Cell 17: 479-490) y, por consiguiente, su inhibición tiene interés terapéutico. Hasta ahora, se han diseñado algunos inhibidores de la enzima UDG codificada por el virus herpes simple de tipo 1 (SHV-1). Estos compuestos sintéticos no proteicos se han ensayado en sistemas in vitro. Por otra parte, se sabe que la proteína UGI codificada por el bacteriófago PBS2 inhibe la enzima UDG del virus SHV-1. Sin embargo, una desventaja de este inhibidor es que bloquea la actividad de la UDG de la enzima UNG2 humana.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención se basa en el uso de una proteína que tiene la capacidad de inhibir la enzima UDG, como un agente terapéutico. Puesto que la actividad de la UDG de algunos virus es esencial para el proceso infectivo, dicha proteína podría ser una herramienta útil para diseñar compuestos antivíricos.

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento de la misma que tiene la capacidad de inhibir la enzima UDG, para usar como un agente terapéutico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica dicha proteína.

En otro aspecto, la invención se refiere a una construcción génica que comprende dicho polinucleótido.

En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica o dicho vector.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para obtener dicha proteína, que comprende cultivar dicha célula en condiciones que permitan producir dicha proteína y, si se desea, recuperar dicha proteína del medio de cultivo.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende dicha proteína.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha proteína, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de dicha proteína en la preparación de una composición farmacéutica antivírica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la actividad de UDG en extractos de B. subtilis. El sustrato ssDNA-U16 (S) radiactivamente marcado (0,55 ng) se incubó con la cantidad especificada de extracto en ausencia de Mg2+. Como control interno, el sustrato se incubó con la enzima UDG de E. coli. Las mezclas de reacción se trataron o no con NaOH. La formación del producto de corte y empalme (P) se analizó en geles de poliacrilamida–urea.

La Figura 2 muestra la inhibición de la actividad de UDG de B. subtilis por la proteína p56. Se añadió la cantidad especificada de p56 a 1,6 g de extracto. Las reacciones se trataron con NaOH.

La Figura 3 muestra la coelución de la UDG de B. subtilis con la proteína p56FLAG usando columnas anti-FLAG M2 (Sigma). La masa molecular (kDa) de los marcadores usados se indica a la derecha.

La Figura 4 muestra la interacción de la proteína p56 con la enzima UDG de E. coli analizada en... [Seguir leyendo]

1. Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma, o una variante de dicha proteína, que tiene una identidad de al menos 60% con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, la cual tiene la capacidad de inhibir la enzima uracilo ADN glicosilasa

5 (UDG), como un agente terapéutico.

2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha variante tiene una identidad de al menos 70%.

3. Proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicha variante tiene una identidad de al menos 85%.

10 4. Proteína de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha variante tiene una identidad de al menos 95%.

5. Proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, para usar en el tratamiento y/o prevención de una infección vírica.

6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 15 a 5.

7. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, y un vehículo inerte.

8. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.