PROCEDIMIENTO DE INDUCCIÓN DE DIFERENCIACIÓN DE UNA CÉLULA MUSCULAR ESQUELÉTICA.

Procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas,

que comprende las etapas de (a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina como un agente incrementador de AMP cíclico o un análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDG-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea no son tratadas con agente desmetilante, y cultivar las células; (b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a), y cultivar las células para obtener un cultivo de mioblastos, con la condición de que dicho cultivo no contenga un co-cultivo de las células con el gen introducido y células sin el gen introducido; y (c) la etapa de añadir un ligando Notch al cultivo de mioblastos obtenido en la etapa (b), y cultivar las células

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2005/023598.

Solicitante: KYOTO UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 36-1, YOSHIDAHONMACHI, SAKYO-KU KYOTO-SHI, KYOTO 606-8501 JAPON.

Inventor/es: DEZAWA,Mari, NABESHIMA,Yo-ichi, HOSHINO,Mikio.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 22 de Diciembre de 2005.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N5/06B6K

Clasificación PCT:

  • A61K35/28 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Médula ósea; Células madre hematopoyéticas; Células madre mesenquimales de cualquier origen, p. ej. células madre derivadas de tejido adiposo.
  • A61K35/34 A61K 35/00 […] › Músculos; Células del músculo liso; Corazón; Células madre cardiacas; Mioblastos; Miocitos; Cardiomiocitos (músculo liso vascular A61K 35/44).
  • A61P21/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema muscular o neuromuscular.
  • A61P21/04 A61P […] › A61P 21/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema muscular o neuromuscular. › para la miastenia grave.
  • A61P41/00 A61P […] › Medicamentos utilizados en cirugía, p. ej. auxiliares quirúrgicos para prevenir adherencias o para la sustitución del humor vítreo.
  • A61P43/00 A61P […] › Medicamentos para usos específicos, no previstos en los grupos A61P 1/00 - A61P 41/00.
  • C12N15/09 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.

PDF original: ES-2362791_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas.

Antecedentes

Para las enfermedades musculares, especialmente, las enfermedades degenerativas de los músculos esqueléticos, tales como distrofia muscular, no hay disponible, en la actualidad, ningún medio terapéutico efectivo. Si pueden prepararse células musculares esqueléticas a partir de células estromales de médula ósea del propio paciente, se hace posible un trasplante autólogo, que se considera que es un procedimiento terapéutico efectivo. Además, la utilización de células musculares esqueléticas generadas a partir de células estromales de médula ósea del propio paciente se espera que, no solo en aspectos terapéuticos, tales como la medicina de regeneración indicada anteriormente, sino también en aspectos de ingeniería, tales como órganos artificiales, tenga posibilidades de un desarrollo futuro. Debido a que las células musculares pueden ser preparadas fácilmente mediante un procedimiento a nivel de cultivo, el uso de las células se espera también en la preparación de órganos artificiales, de tipo híbrido, y similares.

Como un procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, se conoce el procedimiento divulgado en la publicación de patente japonesa, no examinada, (KOKAI) No. 2003-144155. Este procedimiento comprende, como etapas esenciales, (a) la etapa de aislar células estromales de médula ósea de la médula ósea y cultivar las células; (2) la etapa de añadir un agente desmetilante (5-azacitidina); (3) la etapa de añadir un agente incrementador de cAMP o un análogo de cAMP (forskolina), y/o un factor estimulador de diferenciación celular (bFGF, PDGF-AA, heregulin); (4) la etapa de introducir un gen Notch y/o un gen relacionado con el señalamiento Notch en las células y cultivar las células; (5) la etapa de co-cultivar dichas células, con genes introducidos, con células sin genes introducidos; y (6) la etapa de añadir un agente incrementador de cAMP o un análogo de cAMP (forskolina).

Sin embargo, el procedimiento indicado anteriormente incluye seis etapas, y, de esta manera, tiene el problema de que las operaciones son muy complicadas. Si se realizan múltiples etapas con operaciones complicadas, se incrementan los factores indefinidos, lo cual puede conducir a un decrecimiento en la eficiencia de la inducción. Además, este procedimiento se propone básicamente como un procedimiento para inducir diferenciación en células nerviosas, y no está optimizado para inducir selectivamente la diferenciación en células musculares esqueléticas. Además, este procedimiento usa un sistema de mezclado que contiene elementos diferentes a miocitos, y, por lo tanto, el procedimiento tiene un problema desde un punto de vista de la seguridad para aplicaciones clínicas de células musculares esqueléticas inducidas.

El documento EP 1 479 767 A1 divulga dos procedimientos diferentes:

1. un procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en neuronas (dopaminérgicas o acetilcolinérgicas);

2. un procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en células musculares esqueléticas.

Con respecto al procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en células neuronales, el documento EP 1 479 767 A1 divulga que las células estromales de médula ósea (MSCs) son primero transfectadas con el gen notch, son cultivadas y, a continuación, son puestas en contacto con factores de diferenciación y forskolina (un agente incrementador de cAMP).

Con respecto al procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en células musculares esqueléticas, el documento EP 1 479 767 A1 enseña que las células estromales de médula ósea (MSCs) son desmetiladas, cultivadas, puestas en contacto con factores de diferenciación y un agente incrementador de cAMP, a continuación, las células son transfectadas con el gen notch, a continuación, las células transfectadas son cultivadas con células no transfectadas y, a continuación, una vez más, se añade un agente incrementador de cAMP.

En el documento EP 1 479 767 A1, se enseña que la etapa de desmetilación es esencial, ya que la desmetilación y la activación de uno o muy pocos genes mediante 5-azacitidina conduce a la conversión en mioblastos, los cuales son precursores de células musculares.

El documento de Dezawa et al. (The Journal of Clinical Investigation, Vol. 113, No: 12, páginas 1701-1710 (2004)) divulga un procedimiento de inducción de diferenciación de BMSCs a células neuronales.

El documento LI et al. (Immunity, Vol. 8, páginas 43-55 (1998)) divulga que el ligando Notch Jagged juega un papel en la medicación de las decisiones del destino celular en células madre, durante la hematopoyesis. Específicamente, el documento divulga que rJagged1 funciona como un ligando para Notch1, lo cual fue demostrado mediante la inhibición de diferenciación de células musculares en células C2C12 que expresan Notch1, cultivadas con fibroblastos que expresan proteína rJagged.

Divulgación de la invención

Objeto a conseguir por medio de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de inducción de diferenciación a partir de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas. Más específicamente, el objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para inducir, más eficiente y convenientemente, la diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, con buena reproducibilidad en comparación con el procedimiento divulgado en la publicación de patente japonesa, no examinada, No. 2003-144155.

Medios para conseguir el objeto

Los inventores de la presente invención condujeron varias investigaciones para conseguir el objeto indicado anteriormente. Como resultado, encontraron que, en la inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, (2) la etapa de añadir un agente desmetilante (5-azacitidina), (5) la etapa de co-cultivar células con genes introducidos con células sin genes introducidos; y (6) la etapa de añadir un agente incrementador de cAMP o un análogo de cAMP (forskolina), etapas que son consideradas como esenciales en el procedimiento divulgado en la publicación de patente japonesa, no examinada, No. 2003-144155, fueron omitidas exitosamente, de manera que las operaciones del procedimiento total fueron simplificadas para incrementar marcadamente la eficiencia de inducción de diferenciación y crear eficientemente células musculares esqueléticas. La presente invención fue conseguida en base al descubrimiento indicado anteriormente.

De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, que comprende las etapas siguientes:

(a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina, como un agente incrementador de AMP cíclico (en adelante, abreviado también ocasionalmente, como “cAMP”), o como un análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea son células no tratadas con un agente desmetilante, y cultivar las células;

(b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a) indicada anteriormente, y cultivar las células para obtener un cultivo de mioblastos, en el que dicho cultivo no contiene un co-cultivo de las células con el gen introducido y células sin gen introducido; y

(c) la etapa de añadir un ligando Notch al cultivo de mioblastos obtenido en la etapa (b) anterior, y cultivar las células.

Según las realizaciones preferentes de la invención indicada anteriormente, se proporcionan el procedimiento indicado anteriormente, en el que se usa la proteína Jagged 1 como ligando Notch en la etapa (c); y el procedimiento indicado anteriormente, en el que la etapa (c) es realizada en un medio sin suero.

Desde otro aspecto, la presente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, que comprende las etapas de

(a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina como un agente incrementador de AMP cíclico o un análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDG-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea no son tratadas con agente desmetilante, y cultivar las células;

(b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a), y cultivar las células para obtener un cultivo de mioblastos, con la condición de que dicho cultivo no contenga un co-cultivo de las células con el gen introducido y células sin el gen introducido; y

(c) la etapa de añadir un ligando Notch al cultivo de mioblastos obtenido en la etapa (b), y cultivar las células.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ligando Notch es proteína Jagged 1.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (c) es realizada en un medio libre de suero.

15 4. Procedimiento para la inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en mioblastos, que comprende las etapas de:

(a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina como un agente incrementador de AMP cíclico o como análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDG-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea no son tratadas con un agente desmetilante, y cultivar las células; y

(b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a), y cultivar las células, con la condición de que dicho cultivo no contenga un co-cultivo de las células introducidas con el gen y células no introducidas.


 

Patentes similares o relacionadas:

PROMOTOR DE LA FUSIÓN CELULAR Y UTILIZACIÓN DEL MISMO, del 6 de Septiembre de 2011, de KOWA COMPANY, LTD. KITAKAZE, MASAFUMI MINAMINO, TETSUO HIRATA, AKIO: Un método in vitro para producir células fusionadas, que comprende fusionar una célula madre somática y una célula somática en presencia de […]

CÉLULAS DERIVADAS DEL MÚSCULO (MDCS) PARA PROMOVER Y POTENCIAR LA REGENERACIÓN Y REPARACIÓN DE NERVIOS, del 11 de Marzo de 2011, de THE UNIVERSITY OF PITTSBURGH: Células derivadas de músculo (MDCs) autólogas, excluyendo las MDCs embrionarias humanas, para ser usadas en promover o potenciar la neurorrecuperación después […]

Regiones epítopo de un receptor de tirotropina (TSH), sus usos y anticuerpos para las mismas, del 8 de Mayo de 2019, de RSR LIMITED: Un kit para la detección de autoanticuerpos para un receptor de TSH en una muestra de fluido corporal obtenida de un sujeto que se sospecha que padece, es susceptible […]

Promotores de levadura de Pichia pastoris, del 8 de Mayo de 2019, de Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences: Un ácido nucleico aislado en donde el ácido nucleico aislado comprende una secuencia al menos el 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o al menos el 90 % idéntica a un fragmento […]

Composiciones de linfocitos T deficientes en el receptor de linfocitos T, del 6 de Mayo de 2019, de THE TRUSTEES OF DARTMOUTH COLLEGE: Un método para producir uno o más linfocitos T primarios humanos modificados, que comprende expresar en uno o más linfocitos T primarios humanos […]

Anticuerpo anti-receptor de IL-23 humano nuevo, del 1 de Mayo de 2019, de ASTELLAS PHARMA INC.: Anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 5 y una región […]

Selección de células que expresan polipéptidos heterómeros, del 30 de Abril de 2019, de IMMUNEX CORPORATION: Un método para producir y aislar un complejo de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina heterómera que comprende transfectar células con un vector […]

Anticuerpos anti-CD52, del 29 de Abril de 2019, de GENZYME CORPORATION: Un anticuerpo anti-CD52 humana o un fragmento de unión a antígeno fragmento de este, en donde dicho anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera […]

Otras patentes de KYOTO UNIVERSITY

 

Otras patentes de la CIP C12N5/10