Procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas,

que comprende las etapas de (a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina como un agente incrementador de AMP cíclico o un análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDG-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea no son tratadas con agente desmetilante, y cultivar las células; (b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a), y cultivar las células para obtener un cultivo de mioblastos, con la condición de que dicho cultivo no contenga un co-cultivo de las células con el gen introducido y células sin el gen introducido; y (c) la etapa de añadir un ligando Notch al cultivo de mioblastos obtenido en la etapa (b), y cultivar las células

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas.

Antecedentes

Para las enfermedades musculares, especialmente, las enfermedades degenerativas de los músculos esqueléticos, tales como distrofia muscular, no hay disponible, en la actualidad, ningún medio terapéutico efectivo. Si pueden prepararse células musculares esqueléticas a partir de células estromales de médula ósea del propio paciente, se hace posible un trasplante autólogo, que se considera que es un procedimiento terapéutico efectivo. Además, la utilización de células musculares esqueléticas generadas a partir de células estromales de médula ósea del propio paciente se espera que, no solo en aspectos terapéuticos, tales como la medicina de regeneración indicada anteriormente, sino también en aspectos de ingeniería, tales como órganos artificiales, tenga posibilidades de un desarrollo futuro. Debido a que las células musculares pueden ser preparadas fácilmente mediante un procedimiento a nivel de cultivo, el uso de las células se espera también en la preparación de órganos artificiales, de tipo híbrido, y similares.

Como un procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, se conoce el procedimiento divulgado en la publicación de patente japonesa, no examinada, (KOKAI) No. 2003-144155. Este procedimiento comprende, como etapas esenciales, (a) la etapa de aislar células estromales de médula ósea de la médula ósea y cultivar las células; (2) la etapa de añadir un agente desmetilante (5-azacitidina); (3) la etapa de añadir un agente incrementador de cAMP o un análogo de cAMP (forskolina), y/o un factor estimulador de diferenciación celular (bFGF, PDGF-AA, heregulin); (4) la etapa de introducir un gen Notch y/o un gen relacionado con el señalamiento Notch en las células y cultivar las células; (5) la etapa de co-cultivar dichas células, con genes introducidos, con células sin genes introducidos; y (6) la etapa de añadir un agente incrementador de cAMP o un análogo de cAMP (forskolina).

Sin embargo, el procedimiento indicado anteriormente incluye seis etapas, y, de esta manera, tiene el problema de que las operaciones son muy complicadas. Si se realizan múltiples etapas con operaciones complicadas, se incrementan los factores indefinidos, lo cual puede conducir a un decrecimiento en la eficiencia de la inducción. Además, este procedimiento se propone básicamente como un procedimiento para inducir diferenciación en células nerviosas, y no está optimizado para inducir selectivamente la diferenciación en células musculares esqueléticas. Además, este procedimiento usa un sistema de mezclado que contiene elementos diferentes a miocitos, y, por lo tanto, el procedimiento tiene un problema desde un punto de vista de la seguridad para aplicaciones clínicas de células musculares esqueléticas inducidas.

El documento EP 1 479 767 A1 divulga dos procedimientos diferentes:

1. un procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en neuronas (dopaminérgicas o acetilcolinérgicas);

2. un procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en células musculares esqueléticas.

Con respecto al procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en células neuronales, el documento EP 1 479 767 A1 divulga que las células estromales de médula ósea (MSCs) son primero transfectadas con el gen notch, son cultivadas y, a continuación, son puestas en contacto con factores de diferenciación y forskolina (un agente incrementador de cAMP).

Con respecto al procedimiento de inducción de células estromales de médula ósea para diferenciarlas en células musculares esqueléticas, el documento EP 1 479 767 A1 enseña que las células estromales de médula ósea (MSCs) son desmetiladas, cultivadas, puestas en contacto con factores de diferenciación y un agente incrementador de cAMP, a continuación, las células son transfectadas con el gen notch, a continuación, las células transfectadas son cultivadas con células no transfectadas y, a continuación, una vez más, se añade un agente incrementador de cAMP.

En el documento EP 1 479 767 A1, se enseña que la etapa de desmetilación es esencial, ya que la desmetilación y la activación de uno o muy pocos genes mediante 5-azacitidina conduce a la conversión en mioblastos, los cuales son precursores de células musculares.

El documento de Dezawa et al. (The Journal of Clinical Investigation, Vol. 113, No: 12, páginas 1701-1710 (2004)) divulga un procedimiento de inducción de diferenciación de BMSCs a células neuronales.

El documento LI et al. (Immunity, Vol. 8, páginas 43-55 (1998)) divulga que el ligando Notch Jagged juega un papel en la medicación de las decisiones del destino celular en células madre, durante la hematopoyesis. Específicamente, el documento divulga que rJagged1 funciona como un ligando para Notch1, lo cual fue demostrado mediante la inhibición de diferenciación de células musculares en células C2C12 que expresan Notch1, cultivadas con fibroblastos que expresan proteína rJagged.

Divulgación de la invención

Objeto a conseguir por medio de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de inducción de diferenciación a partir de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas. Más específicamente, el objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para inducir, más eficiente y convenientemente, la diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, con buena reproducibilidad en comparación con el procedimiento divulgado en la publicación de patente japonesa, no examinada, No. 2003-144155.

Medios para conseguir el objeto

Los inventores de la presente invención condujeron varias investigaciones para conseguir el objeto indicado anteriormente. Como resultado, encontraron que, en la inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, (2) la etapa de añadir un agente desmetilante (5-azacitidina), (5) la etapa de co-cultivar células con genes introducidos con células sin genes introducidos; y (6) la etapa de añadir un agente incrementador de cAMP o un análogo de cAMP (forskolina), etapas que son consideradas como esenciales en el procedimiento divulgado en la publicación de patente japonesa, no examinada, No. 2003-144155, fueron omitidas exitosamente, de manera que las operaciones del procedimiento total fueron simplificadas para incrementar marcadamente la eficiencia de inducción de diferenciación y crear eficientemente células musculares esqueléticas. La presente invención fue conseguida en base al descubrimiento indicado anteriormente.

De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, que comprende las etapas siguientes:

(a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina, como un agente incrementador de AMP cíclico (en adelante, abreviado también ocasionalmente, como “cAMP”), o como un análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea son células no tratadas con un agente desmetilante, y cultivar las células;

(b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a) indicada anteriormente, y cultivar las células para obtener un cultivo de mioblastos, en el que dicho cultivo no contiene un co-cultivo de las células con el gen introducido y células sin gen introducido; y

(c) la etapa de añadir un ligando Notch al cultivo de mioblastos obtenido en la etapa (b) anterior, y cultivar las células.

Según las realizaciones preferentes de la invención indicada anteriormente, se proporcionan el procedimiento indicado anteriormente, en el que se usa la proteína Jagged 1 como ligando Notch en la etapa (c); y el procedimiento indicado anteriormente, en el que la etapa (c) es realizada en un medio sin suero.

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1. Procedimiento de inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en células musculares esqueléticas, que comprende las etapas de

(a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina como un agente incrementador de AMP cíclico o un análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDG-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea no son tratadas con agente desmetilante, y cultivar las células;

(b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a), y cultivar las células para obtener un cultivo de mioblastos, con la condición de que dicho cultivo no contenga un co-cultivo de las células con el gen introducido y células sin el gen introducido; y

(c) la etapa de añadir un ligando Notch al cultivo de mioblastos obtenido en la etapa (b), y cultivar las células.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ligando Notch es proteína Jagged 1.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (c) es realizada en un medio libre de suero.

15 4. Procedimiento para la inducción de diferenciación de células estromales de médula ósea en mioblastos, que comprende las etapas de:

(a) la etapa de añadir uno o más tipos de sustancias seleccionadas de entre el grupo que consiste en forskolina como un agente incrementador de AMP cíclico o como análogo de cAMP, respectivamente, y un factor estimulador de diferenciación celular seleccionado de entre factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDG-AA), neuregulina a un cultivo de células estromales de médula ósea, en el que dichas células estromales de médula ósea no son tratadas con un agente desmetilante, y cultivar las células; y

(b) la etapa de introducir un gen Notch en las células obtenidas en la etapa (a), y cultivar las células, con la condición de que dicho cultivo no contenga un co-cultivo de las células introducidas con el gen y células no introducidas.