GLUCOPROTEÍNA VI Y SUS USOS.

La interacción entre el colágeno y las plaquetas es el primer acontecimiento de la respuesta hemostática normal a la lesión. El colágeno es la principal proteína de la matriz extracelular presente en el subendotelio de los vasos sanguíneos. Cuando se daña el revestimiento del endotelio, como consecuencia de la lesión de la pared del vaso, las fibras de colágeno, las de tipo I y III, quedan expuestas a las plaquetas. Esta interacción conduce a la adhesión plaquetaria, a la activación con una segunda fase de adhesión, a que ocurra la secreción y, finalmente, a la agregación y al desarrollo de un trombo hemostático (Kehrel et al., 1998, Blood 91: 491-9). El mecanismo de las interacciones entre el colágeno y las plaquetas es complejo. Implica, por una parte, la unión 10 directa del colágeno a receptores de plaquetas específicos (p. ej., integrina 2ß1, receptor del colágeno, glucoproteína IV y glucoproteína VI) y, por otra parte, la unión indirecta del colágeno por medio de las proteínas de puente (por ejemplo, factor de von Willebrand (vWF)) que se unen al colágeno y a los receptores de la membrana de las plaquetas. Los informes recientes apoyan un mecanismo en dos etapas para la interacción entre el colágeno y las plaquetas, que consiste en la adhesión plaquetaria seguida de la activación plaquetaria (Verkleij et al., 1998, 15 Blood 91: 3808-16). En la primera etapa, el complejo receptor plaquetario glucoproteína Ib/IX/V se une al vWF que está fijado al colágeno, y luego ocurre la unión directa de la integrina 2ß1 al colágeno (Moroi et al., 1997, Thrombosis and Haemostasis 78: 439-444 y Barnes et al., 1998, Current Opinion in Hematology 6: 314-320). Esta etapa da lugar a plaquetas que se adhieren al subendotelio de los vasos sanguíneos en condiciones fisiológicas. En la segunda etapa de la interacción entre el colágeno y las plaquetas interviene otro receptor plaquetario del 20 colágeno, la glucoproteína VI (Barnes et al., 1998, Current Opinion in Hematology 6: 314-320). Esta fijación conduce a la intensificación de la adhesión y a la activación plaquetaria. Se cree que la glucoproteína VI (GPVI) tiene una importancia menor en la primera etapa de la adhesión, pero que desempeña una función importante en la segunda etapa de la interacción entre colágeno y plaquetas, dando lugar a la activación plaquetaria total y, en consecuencia, a la formación de los agregados de plaquetas (Arai et al., 1995, British J. of Haematology 89: 124-130). 25 La glucoproteína VI (GPVI) es una glucoproteína de la membrana de las plaquetas que interviene en las interacciones entre las plaquetas y el colágeno. En particular, la GPVI es un receptor transmembranario del colágeno que se expresa en la superficie de las plaquetas. La GPVI tiene una masa molecular aparente de 58 kDa en su forma no reducida, y de 62 kDa después de la reducción de los puentes disulfuro, como se determinó mediante su migración por electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Se ha demostrado que el 30 tratamiento de las plaquetas con la N-glucanasa da lugar a un aumento de la migración de la GPVI en SDS-PAGE en dos kDa, que probablemente corresponde a solo un sitio de N-glucosilación. La existencia de una proteína de 62 kDa, más tarde identificada como GPVI, se detectó primero como un antígeno que reconocía el suero de un paciente con púrpura trombocitopénica inmunitaria que responde a esteroides asociada a funciones plaquetarias inducidas por un colágeno defectuoso (Sugiyama et al., 1987, Blood 69: 1712- 1720). El plasma del paciente, así como una preparación de anticuerpos IgG completos, indujo a la agregación irreversible y a la liberación de ATP en el plasma rico en plaquetas normales. Sin embargo, los fragmentos Fab preparados del suero de este paciente bloquearon la agregación plaquetaria inducida por el colágeno (Sugiyama et al., 1987, Blood 69: 1712-172). La importancia de la GPVI en las interacciones entre las plaquetas y el colágeno se confirmó además al comparar la 40 expresión de los receptores plaquetarios del colágeno de un paciente diferente, con un trastorno hemorrágico leve, con la de un individuo normal (Moroi et al., 1989, J. Clin. Invest. 84(5): 1440-5). Las plaquetas del paciente carecían de la agregación y la adhesión inducida por el colágeno, pero retuvieron la agregación y la liberación normales por otros agonistas. En SDS-PAGE bidimensional no reductor se detectó la expresión de una glucoproteína de la membrana de 61 kDa, pero era menor en comparación con los niveles de expresión encontrados en un individuo 45 normal. Esta glucoproteína se denominó glucoproteína VI (GPVI). Las plaquetas del paciente no se unían a las fibrillas de colágeno de tipo I y III, lo que sugiere que la GPVI funciona como un receptor del colágeno implicado en la activación y agregación plaquetaria inducida por el colágeno.   Se ha demostrado que la GPVI se asocia constitutivamente con el receptor de Fc (FcR), y que el FcR no se expresa en las plaquetas que carecen de la GPVI, lo que sugiere que la GPVI y el FcR se coexpresan en las plaquetas (Tsuji et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 23528-31). Además, se ha mostrado que el entrecruzamiento de la GPVI por los fragmentos F(ab)2 de las IgG anti-GPVI da lugar a la fosforilación de la tirosina de la cadena del FcR. El FcR se fosforila en la tirosina cuando las plaquetas se activan por el colágeno, por el péptido relacionado con el colágeno (CRP; Gibbins et al., 1997, FEBS Lett. 413: 255-259) o por la convulxina, el componente del veneno de serpiente que actúa como un agonista plaquetario (Cvx; Lagrue et al., 1999, FEBS Lett. 448: 95-100). La fosforilación se produce en los motivos con tirosina de activación del inmunorreceptor (ITAM) o FcR por cinasas de la familia Src (p59Fyn y p53/56 lyn) (Briddon S. J. y Watson, 1999, Biochem J. 338: 203-9). La fosforilación del FcR permite que Syk, una molécula de señalización, se fije y, a su vez, se fosforile y active a la fosfolipasa C2 (PLC2). Además, se ha mostrado que la estimulación plaquetaria por el colágeno o la Cvx implica la asociación de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3 cinasa) y el conector de la proteína adaptadora por el activador de los linfocitos T (LAT) al FcR (Carlsson et al., 1998, Blood 92: 1526-31). Por lo tanto, el FcR interacciona con la GPVI para 2 efectuar la señalización. Los resultados de los estudios realizados sobre la activación de la vía de transducción de señales de la GPVI sugieren la existencia de similitudes importantes entre la vía de señalización de GPVI en las plaquetas y la utilizada por los receptores para los complejos inmunitarios, tales como los receptores de alta afinidad y de baja afinidad por IgG (FcRI y FcRIII), el receptor de alta afinidad por IgE (FcR I) y el receptor para IgA (FcRI) (Maliszewski et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1665-72). Estos receptores también transmiten la señal a través de la cadena de FcR y Syk. No se ha descrito la expresión de FcRI ni de FcRIII en las plaquetas. El FcRIIa parece ser el único receptor del Fc de la IgG expresado constantemente en las plaquetas, y contiene 1 ITAM. Se ha sugerido que este receptor interviene en la trombocitopenia y las complicaciones tromboembólicas de la trombocitopenia inducida por la heparina (TIH), que es la trombocitopenia inmunitaria inducida por fármacos más habitual (Carlsson et al., 1998, Blood 92: 1526-31), y también puede estar implicado en otra trombocitopenia inmunitaria tal como la trombocitopenia púrpura (Loscalzo, J., y Schafer, A. I., 1998, Thrombosis and Hemorrhage, J. Loscalzo y A. I. Schafer, eds., Baltimore: Williams and Wilkins). Polgar et al (J. Biol. Chem. (1997) 272: 13576-13583) describen que la convulxina, una proteína del veneno de serpiente que activa las plaquetas, suele unirse a la GPVI. 15 Desde su detección, se ha estudiado la función de la GPVI en las interacciones entre las plaquetas y el colágeno y la vía de transducción de señales inducida por la GPVI. Sin embargo, no se ha podido clonar la GPVI debido, al menos en parte, a su abundante O-glucosilación. El no haber podido clonar GPVI ha limitado los experimentos que se pueden realizar para comprender mejor la función de la GPVI en la activación y la agregación plaquetarias inducidas por el colágeno. Además, el desarrollo de los tratamientos de enfermedades, tales como los trastornos 20 hemorrágicos, que se deben a mutaciones en la GPVI o en su promotor se han visto dificultados por la falta de conocimientos sobre las secuencias del ácido nucleico y de los aminoácidos de la GPVI. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de las moléculas de ADNc que codifican las proteínas TANGO 268, siendo todas ellas proteínas transmembranarias. En particular, TANGO 268 representa el receptor del colágeno GPVI que se... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de glucoproteína VI (GPVI), siendo dicha actividad la fijación al colágeno, en donde la primera molécula de ácido nucleico comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de GPVI, en donde la primera molécula de ácido nucleico se selecciona entre (1) una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 9 y (2) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica al menos al 85% a la SEQ ID n.º 9 y que además comprende una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo que está operativamente unido a la primera molécula de ácido nucleico. 2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde la primera molécula de ácido nucleico comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.º 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica al menos al 85% a la SEQ ID n.º 4. 3. Célula hospedadora creada por ingeniería genética para contener una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la célula hospedadora es una célula troncal embrionaria humana. 4. Célula hospedadora según la reivindicación 3, que es una célula hospedadora de mamífero. 5. Célula hospedadora según la reivindicación 3, que es una célula hospedadora de mamífero no humano. 6. Proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad de glucoproteína VI (GPVI), siendo dicha actividad la fijación al colágeno, en donde el primer polipéptido comprende un dominio extracelular de GPVI y que comprende además un segundo polipéptido con una secuencia de aminoácidos heteróloga, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.º 9 o una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos al 85% a la SEQ ID n.º 9. 7. Proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que dicho dominio extracelular incluye los restos aminoacídicos 21 a 269 de la SEQ ID n.º 3. 8. Proteína de fusión según la reivindicación 6, que comprende una secuencia señal. 9. Proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que la secuencia señal comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.º 4 o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos al 85% a la SEQ ID n.º 4. 10. Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que el polipéptido heterólogo comprende un dominio de inmunoglobulina. 11. Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que el polipéptido heterólogo se une al polipéptido que tiene una actividad de GPVI en su extremo amino o en su extremo carboxilo. 12. Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el polipéptido heterólogo comprende la glutatión-S-transferasa. 13. Procedimiento para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, que comprende cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 3 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico. 14. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 para uso como medicamento. 15. Polipéptido codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para uso como medicamento. 16. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 o polipéptido codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso en el tratamiento o en la prevención de un trastorno trombótico. 17. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 o polipéptido codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico. 106   FIGURA 1a 107   FIGURA 1b 108   FIGURA 2 109     111   112   113   114     116   117   FIGURA 6 118   FIGURA 7 119     121   122   123   124     126   127   128   129 FIGURA 12   FIGURA 13   FIGURA 14 131   132   133   FIGURA 17 134     136   137   138   139     141   FIGURA 24 142   143   FIGURA 26 144