Péptido MUC-1 modificado covalentemente con un resto lipídico,

en el que el péptido MUC­ (a) genera una respuesta de célula T específica del antígeno; y (b) comprende una secuencia de 7 a 20 aminoácidos de la secuencia STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (SEC ID nº 5), en el que el péptido está lipidado con un grupo acilo graso monoinsaturado o poliinsaturado

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las respuestas de células T restringidas al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) específicas contra antígenos son un componente importante de las respuestas inmunitarias frente a infecciones víricas y tumores. El diseño y desarrollo de una intervención inmunoterapéutica depende de la comprensión del antígeno diana, así como de su capacidad para ser presentado eficientemente a células T junto con moléculas de MHC clase I y clase II.

Con las técnicas modernas, es posible determinar la afinidad del péptido del antígeno diana por la hendidura de unión al antígeno de las moléculas de MHC clase I y clase II. Sin embargo, no es una tarea fácil predecir la inmunogenicidad de un péptido antigénico dado en la población humana exogámica, dados nuestros repertorios de células T variables. La complejidad aumenta aún más con ciertos antígenos tumorales que a menudo son reconocidos como péptidos “propios”. De este modo, un gen que codifica un antígeno tumoral se expresará en células autólogas normales sin ningún cambio en la secuencia nucleotídica.

Muchos adenocarcinomas, tales como de mama, ovárico, pancreático, y colorrectal, son muy expresados en la superficie celular, y segregan mucina MUC-1 (glucosilada deficientemente) anormal. Como resultado de la glucosilación deficiente, la mucina MUC-1 en estos adenocarcinomas tiene epítopos peptídicos expuestos. Hull, et al., (1989) Cancer Commun. 1:261-267; Burchell et al., (1987) Cancer Res. 47:5476-5482. Esto contrasta con las células del epitelio ductal normales, en las que la mucina MUC-1 se expresa sobre la superficie apical y tiene un núcleo peptídico de una repetición en tándem conservada de 20 unidades de aminoácidos que está muy glucosilado y por lo tanto tiene un núcleo peptídico oculto (críptico). En esta situación normal, se cree que las regiones antigénicas de MUC-1 están inmunológicamente apantalladas.

Los epítopos peptídicos en las regiones de repetición en tándem del núcleo peptídico de mucina MUC-1 se han reconocido como antígenos diana potenciales para inmunoterapia de ciertos adenocarcinomas. Gendler et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 12820-12823; Siddiqui et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2320-2323; Longenecker, et al., (1993) Immunologists. 1:89-95. Se ha demostrado que las células T específicas del péptido MUC-1 tienen el potencial de eliminar células tumorales que poseen mucina MUC-1. Agrawal et al., (1996) J. Immunol. 157. 2089-2095. También se han definido los siguientes epítopos peptídicos permisivos: (1) epítopo del núcleo peptídico de MUC-1 para la respuesta de células T CD4+ restringida a clase II, y (2) un epítopo que tiene la capacidad para unirse a HLA.A11, HLA.A2.1, HLA.A3 y HLA.A1 Agrawal et al., (1995) Cancer Res. 55:2257-2261; Domenech et al., (1995) J. Immunol. 155:4766-4774. La utilidad de estos péptidos como candidatos potenciales a vacunas para la inmunoterapia de diversos cánceres depende de su capacidad para generar respuestas de células T CD4+ y CD8+ fuertes. Generalmente es factible determinar la inmunogenicidad de un péptido diana en ratones tras el cebado in vivo.

Se ha dado a conocer (Agrawal et al., J. Immunol, y Agrawal et al., Cancer Res., más arriba) que se aislaron células T CD4+ y CD8+ específicas del péptido antigénico MUC-1 a partir de PBL obtenidos de donantes multíparos sanos, pero no de mujeres nulíparas o de hombres. Sin embargo, en esos estudios, los sujetos se cebaron in vivo, y las células T aisladas se estimularon in vitro con péptido antigénico MUC-1 soluble como antígeno.

La investigación reciente sugiere que se puede generar in vitro una respuesta primaria de linfocitos de células T (CTL) citotóxicos CD8+ mediante estimulación de células T con estirpes celulares T2

o RMA-S mutantes que se trataron, o “cargaron”, con péptido. DeBruijn et al., (1992) Eur. J. Immunol. 21:2963-2970; DeBruijn et al., (1992) Eur. J. Immunol. 22:3013-3020; Stauss et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7871-7875; Houbiers et al., (1993) Eur. J. Immunol. 23:2072-2077. Como se usa en esta memoria descriptiva, un liposoma que se ha “cargado” con péptido es un producto formulado con antígeno peptídico asociado a la membrana y/o intravesicular. Tal “liposoma cargado” se usa como un vehículo de suministro para “cargar” células con antígeno peptídico. De este modo, una “célula cargada” es aquella que ha recibido efectivamente, o ha captado, antígeno peptídico. Una célula presentadora de antígenos (APC) cargada es aquella que ha captado antígeno peptídico y expresa el antígeno en la superficie celular en el contexto de moléculas de MHC clase I o clase II. Además, se demostró que se podían generar in vitro CTL específico del antígeno usando células de bazo murinas que tienen una concentración elevada de péptido exógeno. Alexander et al., (1991) J. Exp. Med. 173:849-858; Carbone et al., (1988) J. Exp. Med. 167:1767-1779.

Los péptidos solubles proporcionados exógenamente generalmente recorren la ruta de presentación endo-lisosómica para la presentación en el contexto de moléculas de MHC clase II. Townsend et al., (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:601-624; Unanue et al., (1987) Science 236:551-557. Se mostró que los liposomas insensibles al pH sensibilizan las APC para la presentación restringida a clase II. Además, se ha demostrado que a concentración elevada de péptido antigénico encapsulado, un liposoma insensible al pH puede suministrar antígeno a localizaciones tanto endocíticas como citoplásmicas para la presentación mediante moléculas tanto de MHC clase I como de MHC clase II. Harding et al., (1991) J. Immunol. 147:2860-2863; Zhou et al., (1994) Immunomethods 4:229-235.

Se ha demostrado que los PBL pulsados con péptidos solubles son incapaces de inducir células T primarias in vitro. Germain et al., (1993) Annu. Rev. Immunol. 11:403-450. También se demostró que el antígeno encapsulado por liposomas era presentado eficientemente por DC, pero no por macrófagos, para estimular los CTL primarios. Nair et al., (1993) J. Virol, 67:4062-4069. Sin embargo, la purificación y aislamiento de células dendríticas (DC) es una tarea difícil, y requiere un gran número de PBL o de células madre de la médula ósea.

Inicialmente, se consideró que las células dendríticas eran APC potenciales para cebar células T vírgenes (“naive”). Steinman, (1991) Annu. Rev. immunol. 9:271-296. Las células dendríticas se han usado como APC para la estimulación in vitro de respuestas primarias de CTL específicos de antígenos (DeBrujin et al., Eur. J. Immunol. 22, más arriba, Nair et al. , más arriba); Macatonia et al., (1989) J. Exp. Med. 169:1255-1264; Macatonia et al., (1991) Immunology. 74:399-406; Mehta-Damani et al. (1994) J. Immunol. 153: 996-1003; Nair et al., (1992) J. Exp. Med. 175:609-612. Se ha sugerido que las DC son capaces de una agregación intensa con células T sin cebar, y expresan una densidad elevada de moléculas accesorias, tales como B7.1 y B7.2. Tales moléculas accesorias son críticas para la estimulación de células T en reposo vírgenes (Steinman, más arriba). B7.1 es uno de los receptores de “segunda señal” denominados como moléculas coestimulantes. Es el ligando para CD28, y es crítico para la inducción de respuestas TH1. B7.2 es también un ligando para CD28, y está asociado con respuestas TH2. También se incluye en la categoría de moléculas coestimulantes 1CAM-1, que es el ligando natural de LFA, pero también se demuestra que se une a MUC-1. Reginbald et al., (1996) Cancer Res. 56:4244.

Sin embargo, las DC no son buenas candidatas para (1) determinar la inmunogenicidad de diversos péptidos para inmunoterapia, y (II) estimular células T para la expansión para terapia celular adoptiva. A este respecto, la técnica anterior se refiere a la generación de respuestas de CTL CD8+ específicas de antígenos usando DC. La técnica anterior no sugiere cómo generar respuestas CTL CD4+ específicas de antígenos. El experto en la materia reconocerá que existen células T citotóxicas CD4+ que vía la presentación peptídica restringida a clase II. Además, la técnica no sugiere cómo generar una mezcla de células T específicas de antígenos que sean CD8+ (T citotóxicas) y CD4+ (T auxiliares).

El documento WO 96/40066 describe un péptido MUC-1 no lipidado. Samuel et al (1998), International Journal of Cancer 75(2): 295-302 describe cómo estimular la inmunogenicidad incorporando un adyuvante lipídico en un liposoma,... [Seguir leyendo]

1. Péptido MUC-1 modificado covalentemente con un resto lipídico, en el que el péptido MUC

1:

(a) genera una respuesta de célula T específica del antígeno; y

(b) comprende una secuencia de 7 a 20 aminoácidos de la secuencia STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (SEC ID nº 5), en el que el péptido está lipidado con un grupo acilo graso monoinsaturado o poliinsaturado.

2. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según la reivindicación 1, en el que el péptido MUC-1 consiste en una secuencia de 7 a 20 aminoácidos de la secuencia TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (SEC ID nº 23).

3. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según la reivindicación 1 o reivindicación 2, que presenta una secuencia de aminoácidos constituida por entre una y tres copias de un péptido de 7-20 aminoácidos de longitud obtenido del péptido STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (SEC ID nº 5).

4. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta una secuencia de aminoácidos constituida por entre una y tres copias del péptido STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (SEC ID nº 5).

5. Derivado de MUC-1 modificado por un lípido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el lípido se selecciona de entre el grupo constituido por restos de palmitoílo, miristoílo, estearoílo y decanoílo.

6. Derivado de MUC-1 modificado por un lípido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el lípido es un resto de palmitoílo.

7. Composición que comprende un derivado de MUC-1 modificado por un lípido asociado liposómicamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que el liposoma es un liposoma multilaminar.

9. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (SEC ID nº 5).

10. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según la reivindicación 9, que comprende además

(a) un resto de lisina palmitoilada añadido al extremo carboxiterminal del péptido, y (b) un resto de glicina adicional.

11. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia TSAPDTRPA (SEC ID nº: 16).

12. Péptido MUC-1 modificado por un lípido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por: PDTRPA (SEC ID nº: 34), SAPDTRPAP (SEC ID nº: 2), TSAPDTR (SEC ID nº: 13), TSAPDTRPA (SEC ID nº: 16) y STAPPAHGV (SEC ID nº: 1).