FORMULACIONES CON LIGANDO APO2/TRAIL Y USOS DE LAS MISMAS.

Una formulacion estable de ligando Apo-2, que comprende el ligando Apo-2 y sal de aproximadamente 0,

2 M a aproximadamente 0,5 M, en la que dicha formulacion tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 y la sal es una sal de arginina o sulfato sodico

La presente invención se refiere en general a formulaciones de Apo2L/TRAIL. En particular, dichas formulaciones de Apo2L/TRAIL incluyen composiciones liofilizadas y cristalinas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Se han identificado diferentes moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral alfa ("TNF-alfa"), factor de necrosis tumoral beta ("TNF-beta" o "linfotoxinaalfa"), linfotoxina-beta ("LT-beta"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95), ligando Apo-2(también denominado ligando Apo2L o TRAIL), ligando Apo-3 (también denominado TWEAK), APRIL, ligando OPG (también denominado ligando RANK , ODF, o TRANCE), y TALL-1 (también denominado BlyS, BAFF o THANK), como miembros de la familia de factores de necrosis tumoral ("TNF") de las citocinas [Véase, p. ej., Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry y col., Eur. J. Immunol.,

17:689 (1987); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning y col., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage y col. Nature, 357:80-82 (1992), documento WO 97/01633 publicado el 16 de enero, 1997; documento WO 97/25428 publicado el 17 de julio, 1997; Marsters y col., Curr. 20 Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche y col., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne y col., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento WO98/28426 publicado el 2 de julio, 1998; documento WO98/46751 publicado el 22 de octubre, 1998; documento WO/98/18921 publicado el 7 de mayo, 1998; Moore y col., Science, 285:260-263 (1999); Shu y col., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider y col., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay y col., J. Biol. Chem., 274:1597815981 (1999)]. Entre estas moléculas, se ha descrito que están implicados en la muerte celular apoptótica TNF-alfa, TNF-beta, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1, ligando Apo-2 (Apo2L/TRAIL) y ligando Apo-3 (TWEAK). [0003] Apo2L/TRAIL se ha identificado hace varios años como un miembro de la familia de TNF de las citocinas [véase, p. ej., Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)]. El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de longitud entera es una proteína transmembranal de tipo II de 281 aminoácidos de longitud. Algunas células pueden producir una forma soluble natural del polipéptido, por escisión enzimática de la región extracelular del polipéptido [Mariani y col., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)]. Los estudios cristalográficos de las formas solubles de Apo2L/TRAIL ponen de manifiesto una estructura homotrímera similar a las estructuras del TNF y otras proteínas relacionadas [Hymowitz y col., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz y col., Biochemistry, 39:633-644 (2000)]. Sin embargo, se encontró que Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia de los TNF, tiene una característica estructural única en cuanto que tiene 3 restos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad del homotrímero) que se coordinan juntos con un átomo de cinc, y que la unión al cinc es importante para la estabilidad del trímero y la actividad biológica [Hymowitz y col., véase antes; Bodmer y col., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)]. [0004] Se ha descrito en la bibliografía que Apo2L/TRAIL puede tener una función en la modulación del sistema inmunitario, incluyendo enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, y en el tratamiento del VIH [véase, p. ej., Thomas y col., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen y col., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith y col., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song y col., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000); Jeremias y col., Eur. J. Immunol., 28:143-152 (1998); Katsikis y col., J. Exp. Med., 186:1365-1372 (1997); Miura y col., J. Exp. Med., 193:651-660 (2001)]. [0005] También se ha descrito que formas solubles de Apo2L/TRAIL inducen apoptosis en una variedad de células de cáncer in vitro, incluyendo tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, ovario y cerebro, así como melanoma, leucemia y mieloma múltiple [véase, p. ej., Wiley y col., véase antes; Pitti y col., véase antes; Rieger y col., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak y col., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane y col., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani y col., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13: 1817-1824 (1999); Yu y col., Cancer Res., 60:23842389 (2000); Chinnaiyan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)]. Estudios in vivo en modelos de tumores murinos sugieren además que Apo2L/TRAIL, solo o en combinación con quimioterapia o terapia de radiación, puede ejercer sustanciales efectos antitumorales [véase, p. ej., Ashkenazi y col., véase antes; Walzcak y col., véase antes; Gliniak y col., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan y col., véase antes; Roth y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)]. A diferencia de muchos tipos de células de cáncer, parece que la mayoría de los tipos de células humanas normales son resistentes a la inducción de la apoptosis por determinadas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL [Ashkenazi y col., véase antes; Walzcak y col., véase antes]. Jo y col. han descrito que una forma soluble de Apo2L/TRAIL marcada con polihistidina inducía apoptosis in vitro en hepatocitos humanos normales aislados, pero no en los no humanos [Jo y col., Nature Med., 6:564567 (2000); véase también, Nagata, Nature Med., 6: 502-503 (2000)]. Se cree, que determinadas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinante, pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas frente a normales, dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula marcada, contenido de cinc y contenido de % de trímero [Véase, Lawrence y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)]. [0006] Se cree que la inducción de diferentes respuestas celulares mediadas por dicha familia de TNF de citocinas, es iniciada por la unión a sus receptores celulares específicos. Previamente, se identificaron dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55-kDa (TNFR1) y 75-kDa (TNFR2) [Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:31273131 (1990); documento EP 417.563, publicado el 20 de marzo, 1991; Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990); Schall y col., Cell, 61:361 (1990); Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Se encontró que esos TNFR compartían la estructura típica de los receptores de superficie celular incluyendo las regiones extracelular, transmembranal e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores se encontraron también de forma natural como proteínas de unión al TNF solubles. [Nophar, Y. y col., EMBO J., 9:3269 (1990); and Kohno, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990); Hale y col., J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, pág. 113 (P424)]. [0007] La parte extracelular del tipo 1 y 2 de TNFR (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón repetido de secuencia de aminoácidos de 4 dominios (CRD) ricos en cisteína designados de 1 a 4, empezando por el extremo NH2. [Schall y col., véase antes; Loetscher y col., véase antes; Smith y col., véase antes; Nophar y col., véase antes; Kohno y col., véase antes; Banner y col., Cell, 73:431-435 (1993)]. Existe un patrón de CRD repetitivo similar en varias otras proteínas de superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento de nervios p75 (NGFR) [Johnson y col., Cell,

47:545 (1986); Radeke y col., Nature, 325:593 (1987)], el antígeno CD40 de células B [Stamenkovic y col., EMBO J., 8:14.03 (1989)], el antígeno OX40 de células T [Mallet y col., EMBO J., 9: 1063 (1990)] y el antígeno Fas [Yonehara y col., véase antes y Itoh y col., Cell, 66:233-243 (1991)]. Los CRD también se encuentran en las proteínas T2 de tipo TNFR soluble (sTNFR) de los virus de Shope y poxvirus mixoma [Upton y col., Virology, 160:20-29 (1987); Smith y col., Biochem. Biophys. Res. Commun.,

176:335 (1991); Upton y col., Virology, 184:370 (1991)]. El alineamiento óptimo de estas secuencias indica que las posiciones de los restos de cisteína están bien conservadas. Estos receptores se denominan a veces colectivamente miembros de la superfamilia de receptores de TNF/NGF. [0008] Los ligandos de la familia de TNF identificados hasta la fecha, con la excepción de la linfotoxina beta, son típicamente proteínas transmembranales...

1. Una formulación estable de ligando Apo-2, que comprende el ligando Apo-2 y sal de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, en la que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 y la sal es una sal de arginina o sulfato sódico.

2. La formulación de la reivindicación 1, en la que dicha sal es sal de arginina.

3. La formulación de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que la concentración de dicha sal de arginina en la formulación es de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M.

4. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la sal de arginina se selecciona del grupo que consiste en succinato de arginina, sulfato de arginina, malato de arginina, citrato de arginina, tartrato de arginina y fosfato de arginina.

5. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la sal de arginina es succinato de arginina.

6. La formulación de la reivindicación 1, en la que la sal es sulfato sódico.

7. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ligando Apo-2 comprende proteína cristalizada.

8. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha formulación está liofilizada.

9. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el pH de dicha formulación es de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5.

10. La formulación de la reivindicación 9, en la que el pH de dicha formulación es de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5.

11. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la concentración del ligando Apo-2 es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml.

12. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho Apo-2 comprende los aminoácidos 114 a 281 del SEQ ID NO: 1 (Figura 1).

13. La formulación de la reivindicación 12, en la que dicho ligando Apo-2 no está unido o fusionado a un marcador de epítopo.

14. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha formulación comprende además tensioactivo.

15. La formulación de la reivindicación 14, en la que dicho tensioactivo es un polisorbato o poloxámero.

16. La formulación de la reivindicación 14, en la que la concentración de dicho tensioactivo en la formulación es de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,2%.

17. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha formulación comprende además tampón.

18. La formulación de la reivindicación 17, en la que dicho tampón es el tampón Tris.

19. La formulación de la reivindicación 18, en la que el pH de la formulación es de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5.

20. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha formulación además comprende uno o más iones metálicos divalentes.

21. La formulación de la reivindicación 20, en la que dicho uno o más iones metálicos divalentes son cinc.

22. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende un conservante.

23. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha formulación es estable en almacenamiento durante al menos 12 meses.

24. La formulación de la reivindicación 23, en la que dicha formulación es estable al almacenamiento durante al menos 24 meses.

25. Una formulación de ligando Apo-2 liofilizada y estable, que comprende ligando Apo-2 de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, sal de arginina de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, tampón y tensioactivo, en la que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9.

26. La formulación de la reivindicación 25, en la que dicha sal de arginina es succinato de arginina.

27. La formulación de la reivindicación 26, en la que la concentración de dicho succinato de arginina es de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M.

28. La formulación de la reivindicación 25, en la que dicho tampón es tampón de Tris.

29. La formulación de la reivindicación 25, en la que dicho tensioactivo es un polisorbato.

30. La formulación de la reivindicación 25, en la que dicho ligando Apo-2 comprende los aminoácidos 114-281 del SEQ ID NO: 1 (Figura 1).

31. La formulación de la reivindicación 25, en la que dicha formulación comprende además uno o más iones metálicos divalentes.

32. Una formulación estable de ligando Apo-2, que comprende ligando Apo-2 de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, sulfato sódico de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, tampón y tensioactivo, en la que

dicho ligando Apo-2 comprende proteína cristalizada y dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9.

33. La formulación de la reivindicación 32, en la que dicho tampón es tampón de Tris.

34. La formulación de la reivindicación 32, en la que dicho tensioactivo es polisorbato.

35. La formulación de la reivindicación 32, en la que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5.

36. Un procedimiento para hacer una formulación estable de ligando Apo-2, que comprende las etapas de (a) proporcionar ligando Apo-2 de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, sal de arginina o sulfato sódico de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,5 M, tampón y tensioactivo, (b) combinar o mezclar los ingredientes de la etapa (a) para hacer una formulación, y (c) ajustar el pH de la formulación de la etapa (b) de aproximadamente 6 a aproximadamente 9.

37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicha sal de arginina es succinato de arginina.

38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que la concentración de dicho succinato de arginina es de aproximadamente 0,4 M a aproximadamente 0,5 M.

39. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho tampón es tampón de Tris.

40. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho tensioactivo es un polisorbato.

41. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho ligando Apo-2 comprende los aminoácidos 114 a 281 del SEQ ID NO: 1 (Figura 1).

42. Un dispositivo para administrar una formulación de ligando Apo-2 a un mamífero, que comprende un envase que contiene al menos una unidad de dosificación de la formulación de ligando Apo-2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35.

43. El dispositivo de la reivindicación 42, en el que dicho dispositivo es un dispositivo inyector de tipo bolígrafo.

44. El dispositivo de la reivindicación 42, en el que el envase es un cartucho.

45. Un artículo fabricado que comprende un envase que incluye la formulación de Apo2L/TRAIL de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, e instrucciones impresas para usar dicha formulación de Apo2L/TRAIL.

46. El artículo fabricado de la reivindicación 45, en el que dicho envase es una botella, vial, jeringa o tubo de ensayo.

47. El artículo fabricado de la reivindicación 45, que comprende un segundo envase que incluye agua para inyección, disolución salina de Ringer o disolución de dextrosa.

48. Un procedimiento in vitro de inducción de apoptosis en células de mamífero, que comprende exponer las células de mamífero a una cantidad eficaz de la formulación de ligando Apo-2 de la reivindicación 1, 25 o 32.

49. El procedimiento de la reivindicación 48, en el que dichas células de mamífero son células de cáncer.

50. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, para usar en el tratamiento del cáncer en un mamífero.

51. Uso de una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.