Un polipéptido que tiene actividad neurotrófica, que presenta un grado de identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº:

43, consistiendo dicho polipéptido esencialmente de 104 aminoácidos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a polipéptidos de factores neurotróficos, a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de factores neurotróficos, y a anticuerpos que se unen específicamente a los factores neurotróficos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los factores neurotróficos son proteínas naturales que promueven la supervivencia, mantienen la diferenciación fenotípica, previenen la degeneración y potencian la actividad de las células y tejidos neuronales. Los factores neurotróficos se aíslan de tejido neural y de tejido no neural que está inervado por el sistema nervioso, y se han clasificado en grupos relacionados funcional y estructuralmente, también denominados familias, superfamilias o subfamilias. Entre las superfamilias de factores neurotróficos están las superfamilias del factor de crecimiento de fibroblastos, neurotrofina y factor de crecimiento transformante  (TGF-). Las especies individuales de los factores neurotróficos se distinguen por su estructura física, su interacción con sus receptores compuestos, y sus efectos en diferentes tipos de células nerviosas. Están clasificados dentro de la superfamilia de TGF- (Massague, y col., 1994, Trends in Cell Biology, 4:172-178) los ligandos de factores neurotróficos derivados de líneas celulares gliales ("GDNF"; documento WO 93/06116, incorporado en el presente documento por referencia), que incluye GDNF, persefina ("PSP"; Milbrandt y col., 1998, Neuron 20:245-253, incorporado en el presente documento por referencia) y neurturina ("NTN"; documento WO 97/08196, incorporado en el presente documento por referencia). Los ligandos de la subfamilia de GDNF tienen en común su capacidad para inducir la señalización a través del receptor de la tirosina quinasa RET. Estos tres ligandos de la subfamilia de GDNF difieren en sus afinidades relativas por una familia de receptores neurotróficos, los receptores GFR.

Debido a los efectos de los factores neurotróficos en tejidos neuronales, sigue siendo necesario identificar y caracterizar factores neurotróficos adicionales para el diagnóstico y tratamiento de trastornos del sistema nervioso.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a un nuevo factor neurotrófico llamado en el presente documento “neublastina” o “NBN”. La neublastina se clasifica dentro de la subfamilia de GDNF porque comparte regiones de homología con otros ligandos GDNF (véase las Tablas 3 y 4, más adelante) y debido a su capacidad para interaccionar con RET (véase, p. ej., Airaksinen y col., Mol. Cell. Neuroscience, 13, pp. 313-325 (1999)), la neublastina es un factor neurotrófico nuevo y único. A diferencia de los ligandos GDNF, la neublastina presenta una alta afinidad por el complejo receptor GFR3RET y tiene subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos.

En la invención se incluyen los ácidos nucleicos de NBN y los polipéptidos que estos codifican. Los polipéptidos de NBN son biológicamente activos como dímeros, y como monómeros tienen poca o ninguna actividad. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido de neublastina truncado, en el que el extremo amino del polipéptido de neublastina truncado carece de uno o más aminoácidos amino-terminales de un polipéptido de neublastina maduro. Preferiblemente, el polipéptido de neublastina truncado, cuando dimeriza, se une a un polipéptido RET. Preferiblemente, el polipéptido de neublastina truncado activo induce la dimerización del polipéptido RET.

En algunas realizaciones, el polipéptido de neublastina truncado incluye 7 restos de cisteína en las posiciones correspondientes a las posiciones 16, 43, 47, 80, 81, 109 y 111 del polipéptido de neublastina de la SEQ ID Nº: 12 (maduro 113AA), que corresponde, por ejemplo, a las posiciones 43, 70, 74, 107, 108, 136, 138 de la SEQ ID Nº:9. El SEQ ID Nº:9 se numera de forma que los restos de -80 a -1 corresponden a la sección prepro del polipéptido de NBN traducido, y los restos 1-140 corresponden a los 140 aminoácidos de NBN140 madura. Este esquema de numeración se presenta sólo por conveniencia, y no debe sacarse ninguna deducción de ella en relación a una cualquiera o más formas de NBN prepro, pro, madura o truncada descritas en el presente documento.

También está dentro de la invención un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de neublastina truncado. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado tiene menos de 113 aminoácidos de longitud e incluye una secuencia de aminoácidos al menos 70% homóloga con los aminoácidos 28140 de la SEQ ID Nº: 9. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es al menos 80% homóloga con los aminoácidos 42-140 de la SEQ ID Nº 9. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es al menos 90% homóloga con los aminoácidos 42-140 de la SEQ ID Nº 9. Incluso más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es al menos 95% homóloga con los aminoácidos 42-140 de la SEQ ID Nº 9. En otra realización, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina es al menos 99% homóloga con los aminoácidos 42-140 de la SEQ ID Nº 9. En las realizaciones más preferidas, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado comprende los aminoácidos 42-140 de la SEQ ID Nº 9. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado consiste esencialmente en 99 aminoácidos de la SEQ ID Nº 48.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es al menos 80% homóloga con los aminoácidos 39-140 de la SEQ ID Nº 9. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina es al menos 90% homóloga con los aminoácidos 39-140 de la SEQ ID Nº 9. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina es al menos 95% homóloga con los aminoácidos 39-140 de la SEQ ID Nº 9. En las realizaciones más preferidas, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado comprende los aminoácidos 39-140 de la SEQ ID Nº 9. En otra realización, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina es al menos 99% homóloga con los aminoácidos 39-140 de la SEQ ID Nº 9. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado consiste esencialmente en los 102 aminoácidos de la SEQ ID Nº 45.

En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es idéntico, o al menos 80%, 90%, 95% o 99% homóloga con los aminoácidos 29-140 de la SEQ ID Nº: 9, y consta esencialmente de 112 aminoácidos. En realizaciones alternativas, la identidad o porcentaje de homología mencionados antes es con respecto a los aminoácidos 30-140 de la SEQ ID Nº: 9, 31-140 de la SEQ ID Nº: 9, 32-140 de la SEQ ID Nº: 9, 33140 de la SEQ ID Nº: 9, 34-140 de la SEQ ID Nº: 9, 35-140 de la SEQ ID Nº: 9, 36-140 de la SEQ ID Nº: 9, 37-140 de la SEQ ID Nº: 9, 38-140 de la SEQ ID Nº: 9, 40-140 de la SEQ ID Nº: 9 o 41-140 de la SEQ ID Nº:9. En estas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado consiste esencialmente en 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 101 o 100 aminoácidos, respectivamente. En realizaciones específicas, el polipéptido de neublastina truncado es el polipéptido de uno cualquiera de las SEQ ID Nº: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ó 48.

El polipéptido de neublastina truncado se puede obtener proporcionando un polipéptido de neublastina maduro tal como NBN113, y poniendo en contacto el polipéptido de neublastina maduro con al menos una proteasa en condiciones suficientes para producir el polipéptido de neublastina truncado. Preferiblemente, el polipéptido de neublastina truncado se produce como un producto de digestión del polipéptido de neublastina por exoproteasa poniendo en contacto el polipéptido de neublastina maduro con al menos una exoproteasa. Una proteasa preferida es una cualquiera de aminopeptidasa, Endo Lys C y tripsina. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye poner además en contacto el producto de digestión del polipéptido de neublastina por la exonucleasa con una dipeptidil peptidasa.

En una realización, el polipéptido de neublastina truncado es un polipéptido glicosilado. En una realización alternativa, el polipéptido de neublastina truncado no está glicosilado.

1. Un polipéptido que tiene actividad neurotrófica, que presenta un grado de identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 43, consistiendo dicho polipéptido esencialmente de 104 aminoácidos.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido incluye 7 restos de cisteína en las posiciones que corresponden a las posiciones 16, 43, 47, 80, 81, 109 y 111 de la secuencia de polipéptido de la neublastina de SEQ ID Nº: 12.

3. El polipéptido de las reivindicaciones 1 ó 2, que presenta un grado de identidad de al menos 98% con la SEQ ID Nº: 43.

4. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que presenta un grado de identidad de al menos 99% con la SEQ ID Nº: 43.

5. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho polipéptido está glicosilado.

6. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 7.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que dicha célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células de ovario de hámster chino, células HEK 293, células BHK21, células de oocito de Xenopus laevis (XLO). células fúngicas de filamentos, células Sf9, líneas celulares PC12, HiB5, RN33b, células progenitoras neurales humanas, células de melanoma de Bowe, células Daudi, células HeLa y derivados de células HeLa, células HL-60, células HT-1080, células Jurkat, células de carcinoma KB, células de leucemia K-562, células de cáncer de mama MCF-7, células MOLT-4, células Namalwa, células Raji, células RPMI 8226, células U-937, células 2R4 de sublínea WI-38VA13, células de carcinoma de ovario 2780AD, células de heterohibridoma producidas por fusión de células humanas y células de otra especie, células WI-38, células MRC-5, células huésped de mamífero, células progenitoras neurales, células astrocitarias, células T, células madre hematopoyéticas, y células endoteliales cerebrales.

10. Un procedimiento para hacer el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende:

(a) proporcionar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, (b) cultivar la célula huésped, y (c) recuperar el polipéptido.

11. Un procedimiento para hacer el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho polipéptido se obtiene: proporcionando un polipéptido de neublastina maduro, y poniendo en contacto dicho polipéptido de neublastina maduro con al menos una proteasa en condiciones suficientes para producir dicho polipéptido.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido se produce como un producto de digestión del polipéptido de neublastina por una exoproteasa, poniendo en contacto dicho polipéptido de neublastina maduro con al menos una exoproteasa.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha exoproteasa se elige del grupo que consiste en amino peptidasa, Endo Lys C y tripsina.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, que además comprende poner en contacto dicho producto de digestión del polipéptido de neublastina por la exopeptidasa con una dipeptidil peptidasa.

15. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar como un medicamento.

18. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en daño neuronal isquémico, lesión cerebral traumática, neuropatía periférica, dolor neuropático, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis

lateral amiotrófica, y deterioro de la memoria.

19. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en el tratamiento de un trastorno neuronal del sistema nervioso periférico, la médula o la médula espinal.

20. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en el tratamiento de una enfermedad

o trastorno neurodegenerativo en un animal.

21. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para usar en el tratamiento de una neuropatía periférica o dolor neuropático en un mamífero.

22. El polipéptido de la reivindicación 21, en el que dicha neuropatía periférica se selecciona del grupo que consiste en neuropatías inducidas por traumatismo, neuropatías inducidas por virus, neuropatías inducidas por quimioterapia, neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas.

23. El polipéptido de la reivindicación 21, en el que dicho dolor neuropático está asociado con daño de nervios inducido por toxinas, daño de nervios inducido por patógenos, daño de nervios inducido por traumatismo, daño de nervios inducido por fármacos, neuropatía idiopática, neuropatía diabética, daño de nervios inducido por inflamación

o neurodegeneración.

24. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que el polipéptido se suministra directamente al sistema nervioso central.

25. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que el polipéptido se suministra sistémicamente.

26. El polipéptido de la reivindicación 25, en el que el polipéptido se suministra sistémicamente por inyección subcutánea, administración intravenosa o infusión intravenosa.

27. El ácido nucleico de la reivindicación 6, para usar como un medicamento.

28. El ácido nucleico de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en daño neuronal isquémico, lesión cerebral traumática, neuropatía periférica, dolor neuropático, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, y deterioro de la memoria.

29. El ácido nucleico de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento de un trastorno neuronal del sistema nervioso periférico, la médula o la médula espinal.

30. El ácido nucleico de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo en un animal.

31. El ácido nucleico de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento de una neuropatía periférica o dolor neuropático en un mamífero.

32. El ácido nucleico de la reivindicación 31, en el que dicha neuropatía periférica se selecciona del grupo que consiste en neuropatías inducidas por traumatismo, neuropatías inducidas por virus, neuropatías inducidas por quimioterapia, neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas.

33. El ácido nucleico de la reivindicación 31, en el que dicho dolor neuropático está asociado con daño de nervios inducido por toxinas, daño de nervios inducido por patógenos, daño de nervios inducido por traumatismo, daño de nervios inducido por fármacos, neuropatía idiopática, neuropatía diabética, daño de nervios inducido por inflamación o neurodegeneración.

34. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que el ácido nucleico se suministra directamente al sistema nervioso central.

35. Un kit que comprende, en uno o más envases, una sustancia seleccionada del grupo que consiste en el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y el ácido nucleico de la reivindicación 6.