FACTORES DE UNIÓN DEL FACTOR II DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA (IGF-II).

Un dominio de union de IGF-II mutante que comprende la secuencia de aminoacidos de los restos 1511 a 1650 de IGF2R humano con menos de 50 de dichos restos mutados,

en el que E1544 esta sustituido por un resto de aminoacido no acido que es distinto de N, P o G y; en el que dicho dominio de union de IGF-II mutante se une a IGF2 con aumento de la afinidad con respecto a los restos 1511 a 1650 de IGF2R humano

La presente invención se refiere a materiales para uso en el secuestro del factor II de crecimiento similar a la insulina (IGF-II), por ejemplo, en el tratamiento de cáncer. [0002] El receptor de manosa 6-fosfato independiente de cationes de mamífero/factor II de crecimiento similar a la insulina (abreviado IGF2R) es una proteína de membrana integral de tipo I y lectina de tipo P, con múltiples funciones atribuibles a su amplia variedad de ligandos conocidos (1-3). La proteína glicosilada de

270 kDa está constituida por una secuencia señal del extremo N (aminoácidos 1-44), 15 dominios de repetición extracitoplásmicos homólogos (aminoácidos 45-2313), una región transmembrana (aminoácidos 2314-2336) y un dominio citoplásmico del extremo C (aminoácidos 2337-2499) (4,5). Sus 15 dominios repetidos tienen cada uno

147 aminoácidos de longitud y muestran similitud significativa en secuencia de aminoácidos y distribución de disulfuro entre sí (16-38% de identidad) y con el único dominio extracitoplásmico del receptor de manosa 6-fosfato dependiente de cationes (CD-MPR) (14-28% de identidad) (5). Ahora se han resuelto las estructuras cristalinas para los dominios 1, 2, 3 (6) y 11 (7) y muestran que cada dominio tiene una topología similar que está constituida por un barril β de 9 cadenas aplanadas, compartida con CD-MPR y avidina (8), sugiriendo que los 15 dominios extracitoplásmicos representan 15 unidades estructurales homólogas. La función principal de IGF2R y CD-MPR son la liberación de hidrolasas ácidas recientemente formadas, de las que hay 50, al lisosoma mediante la unión a sus restos marcados con manosa 6-fosfato (M6P) (3). El IGF2R también procesa varios otros ligandos marcados con M6P y no M6P. Los dominios 3, 9 y recientemente 5 (9) se han identificado como los sitios de unión para las proteínas manosiladas tales como TGF-β latente (10), proliferina y granzima B y la proteasa catepsina. Los estudios de mutagénesis sitiodirigida han establecido los restos de interacción crítica dentro de los dominios 3 y 9 para manosa 6-fosfato (11, 12). De los ligandos no manosilados actualmente identificados (IGF-II, ácido retinoico, receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa y plasminógeno), el IGF-II ha sido con mucho el mejor estudiado, estando el sitio de unión localizado en el dominio 11 (13-15). [0003] El IGF-II (7,5 kDa) es una hormona pequeña de péptido mitogénico que funciona principalmente durante el crecimiento embrionario en el que su actividad está estrechamente regulada, pero también está frecuentemente desregulada en tumores (16-18). Al igual que IGF-I, IGF-II ejerce su efecto mitogénico predominantemente señalizando mediante el IGF1R, conduciendo a la activación de tirosina cinasa y a la estimulación tanto de la cinasa de proteína activada por mitógeno (MAP) como de la cascada de señalización de PKB/AKT. Las dianas en la dirección 3' incluyen los factores de transcripción FOXO, GSK3β, MDM2 y mTOR que conducen a la regulación por incremento de señales pro-crecimiento y anti-apoptósicas (19). En mamíferos, la estrecha regulación de la actividad de IGF-II se logra por la unión de alta afinidad a seis proteínas de unión a IGF (IGFBP 1-6) y por la unión a IGF2R en la superficie celular, conduciendo a la internalización de IGFII y posterior degradación dentro del lisosoma (20-22). Los estudios de RMN previos han establecido la estructura de IGF-II maduro (23,24) y se ha usado mutagénesis sitiodirigida para identificar los restos F48, R49, S50, A54, L55 como críticos para la interacción con IGF2R (25,26). Aunque el IGF-II está relativamente estructuralmente conservado, el sitio de unión de IGF-II de IGF2R está presente sólo en especies de mamíferos en las que la regulación del crecimiento embriónico y placentario de IGF-II por IGF2R también implica el sellado recíproco de los genes que codifican estas proteínas (27). La alteración de Igf2 en el ratón produce un crecimiento reducido (60% de natural) a partir del día embrionario 9-11 (28, 29), mientras que los ratones con alteración de Igf2r presentan crecimiento fetal excesivo e hiperplasia cardiaca mortal (30, 31). El crecimiento y el fenotipo de letalidad perinatal se rescata cuando Igf2 también se altera, sugiriendo que la función crítica del principio de IGF2R es la regulación de IGF-II (32). Más recientemente se ha destacado la interacción funcional específica entre IGF-II y IGF2R y su función crítica en el desarrollo, ya que los embriones partenogenéticos con expresión del alelo materno Igf2 pueden conducir a desarrollo normal de ratones vivos con dos genomas maternos, y la supresión epigenética de Igf2r puede representar síndrome de la cría grande tras clonación de células somáticas (33, 34). [0004] Los dominios de unión de IGF-II divergen en monotremas, marsupiales y mamíferos euterios (83). [0005] La regulación anómala de la actividad de IGF-II se ha relacionado repetidamente como una característica común de tumores tanto en ratón como en ser humano (35). Por ejemplo, el aumento de la expresión de IGF-II por pérdida de sellado (LOI) se ha descrito en una plétora de tipos de tumores que incluyen tumor de Wilms (36), carcinoma colorrectal (37), rabdomiosarcoma (38), sarcoma de Ewing (39), carcinoma cervical (40), carcinoma de pulmón (41) y feocromocitoma (42). La LOI de IGF2 está particularmente asociada a una disminución del riesgo relativo de desarrollar carcinoma colorrectal (43, 44). El IGF2R también actúa de supresor tumoral ya que la pérdida de heterocigosidad del receptor ha sido detectada en varios tipos de tumores que incluyen tumores de hígado, pulmón y cabeza y cuello (45-48). Además, se ha caracterizado la pérdida de mutaciones de la función del receptor (49) y la sobreexpresión de IGF2R produce una diminución del crecimiento y un aumento de apoptosis en modelos de células tumorales (50-53). La estructura cristalina del dominio 11 de IGF2R se ha resuelto a una resolución de 1,4 Å usando dispersión anómala de azufre (7), y ha sido confirmada por otros (54). La estructura del dominio 11 de IGF2R revela dos sitios hidrófobos sobre la superficie del dominio 11, identificando el primero el posible sitio de unión de IGF-II dentro de la hendidura de la estructura de barril β, espacialmente análogo al sitio de unión de azúcar hidrófilo del CD-MPR, y un segundo que participa en las interacciones dominio-dominio (7, 55). El sitio de unión de IGF-II se forma por las cadenas β A, B, C y D y los bucles AB, CD y FG, confiriendo bucles más cortos una cavidad de unión más superficial que la del CDMPR. Los restos Y1542, S1543, G1546 (bucle AB), F1567, G1568, T1570, I1572 (bucle CD), S1596, P1597, P1599 (bucle FG) se han identificado como que están significativamente expuestos a disolventes y, por tanto, posiblemente participan en la interacción de IGF-II (7). Previamente, Linnell y col. cuantificaron la interacción de IGF-II con el dominio de IGF2R 10-13 expresado en una proteína quimérica de rata CD4 (dominios 3 y 4) usando resonancia de plasmones superficiales (SPR), y se confirmó la actividad potenciadora del dominio 13 con respecto a la interacción del dominio 11-IGF-II (15, 56). [0006] Los presentes inventores han identificado mutantes novedosos del dominio de unión de IGF-II del receptor del factor 2 de crecimiento similar a la insulina (IGF2R) que tienen afinidad de unión potenciada por IGF-II con respecto al dominio de unión de IGF-II natural, pero no muestran ninguna reducción en la especificidad. [0007] Un aspecto de la invención proporciona un dominio de unión de IGF-II que está constituido por la secuencia de aminoácidos de los restos 1511 a 1650 del IGF2R humano con 50 o menos restos mutados o alterados, en el que E1544 está sustituido por un resto de aminoácido no ácido que es distinto de N, P o G y; en el que el dominio de unión de IGF-II se une a IGF-II con aumento de la afinidad con respecto al dominio de unión de IGF-II natural (restos 1511 a 1650) de IGF2R humano, por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces o 7 veces o más de afinidad. La unión del dominio de unión de IGF-II mutante a IGF-II puede tener, por ejemplo, un aumento de la constante de asociación (kas) y/o una reducción de la constante de disociación (kdis) con respecto al dominio de unión de IGF-II natural. [0008] Preferentemente, el dominio de unión de IGF-II muestra una especificidad de unión que es idéntica o similar al dominio de unión de IGF-II natural (restos 1511 a 1650) de IGF2R humano, es decir, muestra no unión o sustancialmente no unión a IGF-I. [0009] El IGF2R humano tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y la entrada en la base de datos NP_000867.1 GI: 4504611 y está codificado por la secuencia...

1. Un dominio de unión de IGF-II mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 1511 a 1650 de IGF2R humano con menos de 50 de dichos restos mutados, en el que E1544 está sustituido por un resto de aminoácido no ácido que es distinto de N, P o G y; en el que dicho dominio de unión de IGF-II mutante se une a IGF2 con aumento de la afinidad con respecto a los restos 1511 a 1650 de IGF2R humano.

2. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 1 que no muestra unión o sustancialmente no se une a IGF1.

3. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los restos mutados están mutados por sustitución, inserción

o delección.

4. Un dominio de unión de IGF mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que resto E1544 está sustituido por un resto básico de aminoácido.

5. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 4, en el que E1544 está sustituido por K.

6. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 4, en el que E1544 está sustituido por R.

7. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 4, en el que E1544 está sustituido por H.

8. Un dominio de unión de IGF mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que E1544 está sustituido por S.

9. Un dominio de unión de IGF mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los restos F1567 y I1572 no están mutados.

10. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 9, en el que T1570 no está mutado.

11. Un dominio de unión de IGF mutante según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que P1597 y P1599 no están mutados.

12. Un dominio de unión de IGF mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que está constituido por la secuencia de aminoácidos de los restos 1511 a 1650 de IGF2R humano con el resto E1544 sustituido por un resto no hidrófobo.

13. Un polipéptido que comprende un dominio de unión de IGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un polipéptido según la reivindicación 13 que comprende dos o más dominios de unión de IGF mutantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

13.

15. Un polipéptido según la reivindicación 13 o la reivindicación 14 que comprende el dominio 13 de IGF2R humano.

16. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 que comprende un dominio Fc de inmunoglobulina.

17. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 que comprende una marca de afinidad.

18. Un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de IGF-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17.

19. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 18.

20. Una célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 19.

21. Un dominio de unión de IGF-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, un ácido nucleico según la reivindicación 18, un vector según la reivindicación

5 19 o una célula hospedadora según la reivindicación 20 para uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.

22. Un dominio de unión de IGF-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, un ácido nucleico según la reivindicación 18, un vector según la reivindicación 19 o una célula hospedadora según la reivindicación 20 para uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer.

23. Uso del dominio de unión de IGF-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, un ácido nucleico según la reivindicación 18, un vector según la reivindicación 19 o una célula hospedadora según la reivindicación 20 en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de cáncer.