EVOLUCIÓN IN VITRO CONTINUA.

Un método para la mutación de una proteína de interés, síntesis de un mutante de la proteína de interés y selección de un mutante de la proteína de interés que se une a una molécula diana que comprende:

a) incubar una molécula de ARN replicable que codifica para la proteína de interés con precursores de ribonucleósido trifosfato de ARN y una ARN polimerasa dirigida por ARN, en el que la ARN polimerasa dirigida por ARN replica la molécula de ARN pero introduce mutaciones generando de ese modo una población de moléculas de ARN mutante; b) incubar las moléculas de ARN mutante de la etapa (a) con un sistema de traducción en condiciones que dan como resultado una síntesis de una población de proteínas mutantes de manera que tras la traducción, las proteínas mutantes se asocian con sus moléculas de ARN codificante formando de ese modo una población de complejos de ARN/proteína mutante; c) seleccionar uno o más complejo(s) de ARN/proteína mutante exponiendo la población de complejos de ARN/ proteína mutante de la etapa (b) a la molécula diana

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/AU1999/000341.

Solicitante: CEPHALON AUSTRALIA (VIC) PTY LTD.

Nacionalidad solicitante: Australia.

Dirección: LEVEL 2, 37 EPPING ROAD MACQUARIE PARK NSW 2113 AUSTRALIA.

Inventor/es: COIA,GREGORY, HUDSON,PETER,JOHN, IRVING,ROBERT,ALEXANDER, ILIADES,PETER.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 7 de Mayo de 1999.

Fecha Concesión Europea: 25 de Agosto de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/08A12
  • C07K16/18 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
  • C12N15/10B
  • C12N15/10C2

Clasificación PCT:

  • C12N15/01 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Preparación de mutantes sin introducción de material genético extraño; Procedimientos de cribado para ello.
  • C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12P21/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Clasificación antigua:

  • C12N15/01 C12N 15/00 […] › Preparación de mutantes sin introducción de material genético extraño; Procedimientos de cribado para ello.
  • C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12P21/00 C12P […] › Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Portugal, Irlanda, Finlandia.


Fragmento de la descripción:

Evolución in vitro continua.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para mutar y seleccionar proteínas de unión diana en un sistema de traducción; y a un constructo de polinucleótido para su uso en este método. El método de la presente invención puede aplicarse a la generación de moléculas de utilidad diagnóstica y terapéutica.

Antecedentes de la invención

La evolución in vitro de proteínas implica introducir mutaciones en secuencias de genes conocidas para producir una biblioteca de secuencias mutantes, traducir las secuencias para producir proteínas mutantes y entonces seleccionar proteínas mutantes con las propiedades deseadas. Este procedimiento tiene el potencial para generar proteínas con utilidades diagnósticas y terapéuticas mejoradas. Desafortunadamente, sin embargo, el potencial de este procedimiento se ha visto limitado por las deficiencias en los métodos actualmente disponibles para la mutación y la generación de bibliotecas.

Por ejemplo, ha resultado difícil la generación de grandes bibliotecas (por ejemplo, más allá de un tamaño de biblioteca de 1010) de genes individuales únicos y sus proteínas codificadas con sistemas de presentación en fago debido a limitaciones en la eficiencia de transformación. Una desventaja adicional es que los métodos que utilizan los sistemas de presentación en fago (figura 1) requieren varias etapas secuenciales de mutación, amplificación, selección y mutación adicional (Irving et al., 1996; Krebber et al., 1995; Stemmer, 1994; Winter et al., 1994).

Ejemplos de procedimientos que se han usado hasta la fecha para la maduración de la afinidad de proteínas seleccionadas, y particularmente para la maduración de la afinidad de anticuerpos, se exponen en la tabla 1. Todos estos métodos se basan en la mutación de genes seguida de la presentación y la selección de las proteínas codificadas. La mutación particular que se elige determina la diversidad en la biblioteca génica resultante. Las estrategias in vitro (tabla 1) se ven muy limitadas por la eficacia en la transformación de genes mutados en la formación de una biblioteca de presentación en fago. En un procedimiento cíclico in vivo (tabla 1 n.º 1), las células mutadoras de E. coli fueron el vehículo para la mutación de genes de anticuerpos recombinantes. Las células mutadoras de E. coli MUTD5-FIT (Irving et al., 1996) que llevan un gen DNAQ mutado podrían usarse como la fuente de los extractos S-30 y por tanto permitir mutaciones introducidas en el ADN durante la replicación como resultado de errores de corrección. Sin embargo, las tasas de mutación son bajas en comparación con la tasa requerida. Por ejemplo, mutar 20 residuos con la permutación completa de 20 aminoácidos requiere un tamaño de biblioteca de 1x1026, una tarea extremadamente difícil con la metodología de presentación en fago actualmente disponible.

TABLA 1 Estrategias de maduración de la afinidad

Un método de selección que permite la producción in vitro de bibliotecas complejas de mutantes que están evolucionando (mutando) continuamente y a partir de las cuales puede seleccionarse el gen deseado, proporcionaría por tanto un medio mejorado de maduración (aumento) de la afinidad de proteínas.

Sistemas de transcripción y traducción acopladas in vitro

Se conoce bien que un plásmido de ADN que contiene un gen de interés puede actuar como molde para la transcripción cuando se controla mediante un elemento de control tal como el promotor T7. También se conoce que pueden usarse sistemas libres de células acoplados para transcribir ARNm y traducir el ARNm en péptidos simultáneamente (Baranov et al. 1993; Kudilicki et al. 1992; Kolosov et al. 1992; Morozov et al. 1993; Ryabova et al. 1989, 1994; Spirin 1990; documento US 5556769; documento US5643768; He y Taussig 1997). La fuente de sistemas libres de células generalmente ha sido extractos S-30 de E. coli (Mattheakis 1994; Zubay 1973) para procariotas y lisados de reticulocitos de conejo para eucariotas. También se han notificado sistemas acoplados de transcripción/traducción (documento US 5492817; documento US 5665563; documento US 5324637) que implican extractos libres de células procariotas (Mattheakis et al. 1994) y extractos libres de células eucariotas (documento US 5492817; documento US 5665563) que tienen diferentes requisitos para la transcripción y la traducción eficaces. Además, existen requisitos para el plegamiento correcto de las proteínas traducidas en los sistemas procariotas y eucariotas. Para procariotas, pueden requerirse disulfuro isomerasa de proteínas (PDI) y chaperonas. Generalmente en procariotas, las proteínas traducidas se pliegan tras su liberación del ribosoma; sin embargo, para el plegamiento correcto de la proteína recién traducida unida (ligada) al ribosoma también puede ser necesario un anclaje C terminal. Un anclaje es un espaciador de polipéptido que une el/los dominio(s) de proteína recién traducida al ribosoma. El anclaje puede ser un dominio de proteína completa tal como una región constante de inmunoglobulina. Completamente al contrario de esto, en los sistemas eucariotas la proteína se pliega a medida que se sintetiza y no requiere de la adición de PDI y chaperonas de procariotas. Sin embargo, un anclaje puede ser beneficioso en sistemas eucariotas para el espaciado de, y el plegamiento correcto de la proteína recién traducida unida (ligada) al ribosoma.

En la superficie de los ribosomas se han presentado polipéptidos sintetizados de novo en sistemas acoplados libres de células, dado que por ejemplo en ausencia de un codón de parada el polipéptido no se libera del ribosoma. Para fines de selección puede usarse el complejo de proteínas de ribosoma de ARNm. Este sistema imita el procedimiento de presentación en fago y selección y se muestra en la figura 1. Las características requeridas para la presentación óptima en ribosomas se han descrito por Hanes y Pluckthun (1997). Estas características incluyen la eliminación de codones de parada. Sin embargo, la eliminación de codones de parada da como resultado la adición de sitios sensibles a proteasa en el extremo C terminal de la proteína recién traducida codificada por una estructura de tipo ARNt de ssrA. Esto puede evitarse mediante la inclusión de oligonucleótidos de ssrA antisentido (Keiler et al 1996).

ARN polimerasas dirigidas por ARN

El bacteriófago Qβ es un fago de ARN con una replicasa eficaz (las ARN polimerasas dependientes de ARN se denominan replicasas o sintetasas) para replicar el genoma monocatenario de colifago Qβ. La Qβ replicasa es propensa a error e introduce mutaciones en el ARN calculadas in vivo en 103-104 bases. La fidelidad de la Qβ replicasa es baja y está fuertemente sesgada para replicar su molde (Rohde et al. 1995). Estas enseñanzas indican que la replicación durante un periodo prolongado conduce a la acumulación de cadenas mutadas no adecuadas para la síntesis de una proteína deseada. Tanto las cadenas + como - sirven como moldes para la replicasa; sin embargo, para el genoma viral la cadena + se une mediante la Qβ replicasa y se usa como el molde para la cadena complementaria (-). Con el fin que se produzca la replicación del ARN, la replicasa requiere elementos estructurales/secuencia de ARN específicos que se han definido bien (Brown y Gold 1995; Brown y Gold 1996). Una reacción que contiene 0,14 femtogramos de ARN recombinante produce 129 nanogramos en 30 minutos (Lizardi et al. 1988).

Se conoce que las ARN polimerasas dirigidas por ARN replican ARN de manera exponencial en moldes compatibles. Los moldes compatibles son moléculas de ARN con estructura secundaria tal como la observada en ARN MDV-1 (Nishihara, T., et al. 1983). Con respecto a esto, se ha descrito un vector para construir ARNm amplificables ya que éste tiene las secuencias y la estructura secundaria (ARN MDV-1) requeridas para la replicación y se replica in vitro de la misma manera que el ARN genómico de Qβ. La secuencia de ARN MDV-1 (un molde que se produce de manera natural para la Qβ replicasa) es uno de varios moldes naturales compatibles con la amplificación del ARN mediante la Qβ...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para la mutación de una proteína de interés, síntesis de un mutante de la proteína de interés y selección de un mutante de la proteína de interés que se une a una molécula diana que comprende:

a) incubar una molécula de ARN replicable que codifica para la proteína de interés con precursores de ribonucleósido trifosfato de ARN y una ARN polimerasa dirigida por ARN, en el que la ARN polimerasa dirigida por ARN replica la molécula de ARN pero introduce mutaciones generando de ese modo una población de moléculas de ARN mutante;

b) incubar las moléculas de ARN mutante de la etapa (a) con un sistema de traducción en condiciones que dan como resultado una síntesis de una población de proteínas mutantes de manera que tras la traducción, las proteínas mutantes se asocian con sus moléculas de ARN codificante formando de ese modo una población de complejos de ARN/proteína mutante;

c) seleccionar uno o más complejo(s) de ARN/proteína mutante exponiendo la población de complejos de ARN/ proteína mutante de la etapa (b) a la molécula diana.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que las etapas (a) a (c) se repiten una o más veces, en el que la molécula de ARN replicable usada en la etapa (a) es el ARN obtenido del/de los complejo(s) seleccionado(s) en la etapa (c).

3. Un método según la reivindicación 2, en el que las etapas (a) a (c) se repiten más de una vez, en el que la molécula de ARN replicable usada en la etapa (a) es el ARN obtenido del/de los complejo(s) seleccionado(s) en la etapa (c).

4. Un método según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que las etapas (a) a (c) se llevan a cabo simultáneamente en un recipiente o bien de una sola cámara o bien de múltiples cámaras, en el que el recipiente de múltiples cámaras permite la transferencia de fluidos entre cámaras.

5. Un método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de recuperar el/los com- plejo(s) de ARN/proteína mutante de la etapa (c) unido(s) a la molécula diana.

6. Un método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de liberar las moléculas de ARN del/de los complejo(s) de la etapa (c).

7. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN replicable es ARNm.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que la molécula de ARNm replicable se deriva de un molde seleccionado del grupo que consiste en ARN RQ135, ARN MDV-1, ARN microvariante, ARN nanovariantes, CT-ARN y ARN RQ120.

9. Un método según la reivindicación 7, en el que la molécula de ARNm replicable se deriva de un vector que comprende un molde seleccionado de ARN MDV-1 y ARN RQ135.

10. Un método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de transcribir un molde de ADN para producir el ARN replicable.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el molde de ADN es una molécula de ADN lineal.

12. Un método según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el molde de ADN comprende:

(i) una región no traducida que comprende un elemento de control que promueve la transcripción del ADN en ARN y un sitio de unión a ribosoma;

(ii) un marco de lectura abierto que codifica para la proteína que se une a la molécula diana; y

(iii) una estructura de horquilla situada en el sentido de 5' del marco de lectura abierto.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que la estructura de horquilla es una secuencia de unión a replicasa.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que la secuencia de unión a replicasa tiene una longitud de entre 15 y 50 nucleótidos.

15. Un método según la reivindicación 13, en el que la secuencia de unión a replicasa tiene una longitud de entre 20 y 40 nucleótidos.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la Qβ replicasa reconoce la secuencia de unión a replicasa.

17. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la secuencia de unión a replicasa comprende la secuencia: GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCG.

18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que una segunda estructura de horquilla se incluye en el sentido de 3' del marco de lectura abierto.

19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en el que el sitio de unión a ribosoma se deriva del virus MS2.

20. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que una secuencia que codifica para un polipéptido se fusiona en 3' y en marco con el marco de lectura abierto.

21. Un método según la reivindicación 20, en el que el polipéptido es una región constante de inmunoglobulina.

22. Un método según la reivindicación 21, en el que el dominio constante de inmunoglobulina es un dominio ligero constante del anticuerpo de ratón 1C3.

23. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que las proteínas mutantes se asocian con sus moléculas de ARN codificantes por medio de complejos de ribosoma.

24. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que el sistema de traducción es un sistema de traducción libre de células.

25. Un método según la reivindicación 24, en el que el sistema de traducción libre de células comprende un extracto S-30 de Escherichia coli.

26. Un método según la reivindicación 24, en el que el sistema de traducción libre de células comprende un lisado de reticulocitos.

27. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el sistema de traducción comprende células completas.

28. Un método según la reivindicación 27, en el que las proteínas mutantes se asocian con sus moléculas de ARN codificante mediante asociación con o ubicación dentro de la misma célula.

29. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que el sistema de traducción comprende glutatión oxidado y/o reducido en una concentración total de entre 0,1 mM y 10 mM.

30. Un método según la reivindicación 29, en el que la concentración de glutatión está entre 2 mM y 7 mM.

31. Un método según la reivindicación 29, en el que el sistema de traducción comprende glutatión oxidado a una concentración de aproximadamente 2 mM y glutatión reducido a una concentración de entre 0,5 mM y 5 mM.

32. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que la ARN polimerasa dirigida por ARN

(i) introduce mutaciones en la molécula de ARN replicado a una frecuencia de al menos una mutación puntual en 104 bases; o

(ii) introduce al menos una inserción o deleción a una frecuencia de 10-4.

33. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que la ARN polimerasa dirigida por ARN

(i) introduce mutaciones en la molécula de ARN replicado a una frecuencia de al menos una mutación puntual en 103 bases; o

(ii) introduce al menos una inserción o deleción a una frecuencia de 10-3.

34. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que la ARN polimerasa dirigida por ARN se selecciona del grupo que consiste en Qβ replicasa, ARN polimerasa dirigida por ARN de hepatitis C, ARN polimerasa dirigida por ARN del virus de la estomatitis vesicular, replicasa del virus del mosaico amarillo del nabo y ARN dependiente de ARN de bacteriófago phi 6 de ARN.

35. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en el que la ARN polimerasa dirigida por ARN es Qβ replicasa.

36. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que la molécula diana se selecciona de una molécula de ADN, una proteína, un receptor, una molécula de superficie celular, un metabolito, un anticuerpo, una hormona, una bacteria o un virus.

37. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula diana se une a una matriz.

38. Un método según la reivindicación 37, en el que la matriz comprende perlas magnéticas.


 

Patentes similares o relacionadas:

Anticuerpos anti-alfa-sinucleína y procedimientos de uso, del 29 de Julio de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Un anticuerpo anti-alfa-sinucleína humana que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 que […]

Terapia basada en anticuerpos de la amiloidosis por transtiretina (TTR) y anticuerpos de origen humano para ese propósito, del 22 de Julio de 2020, de Neurimmune Holding AG: Un anticuerpo anti-transtiretina (TTR) de origen humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es capaz de unirse a especies de TTR mutadas, mal plegadas, […]

Polipéptidos biparatópicos antagonistas de la señalización WNT en células tumorales, del 15 de Julio de 2020, de Boehringer Ingelheim International GmbH & Co. KG: Un polipéptido que se une específicamente a LRP5 o LRP6, que comprende - un primer dominio variable individual de inmunoglobulina seleccionado del grupo de dominios […]

PTPRS y proteoglicanos en enfermedad autoinmune, del 15 de Julio de 2020, de LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGY AND IMMUNOLOGY: Una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS, donde la proteína comprende tanto el dominio 1 (Ig1) […]

Redirectores de células T específicas de antígenos, del 1 de Julio de 2020, de THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY: Una nanoparticula que comprende en su superficie: (A) un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno de celula diana o epitopo del mismo; y (B) un resto […]

Anticuerpos scFv que pasan las capas epitelial y/o endotelial, del 1 de Julio de 2020, de ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC: Un anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende: (a) un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene tres regiones CDR de VL no […]

Un antígeno asociado con artritis reumatoide, del 24 de Junio de 2020, de PHILOGEN S.P.A.: Un conjugado de anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento de la artritis reumatoide en un paciente, en el que el conjugado de anticuerpo comprende […]

Moléculas de unión con cadena J modificada, del 24 de Junio de 2020, de IGM BIOSCIENCES, INC: Una molécula de unión que comprende un anticuerpo de IgM, IgA, IgG/IgM o IgG/IgA con una cadena J modificada, donde la cadena J modificada comprende una cadena […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .