Un procedimiento de ensayo in vivo o in vitro para monitorizar la eficiencia de unión de L104EA29Ylg a receptor CD86 en un paciente,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) proporcionar una muestra de sangre de un paciente dosificado con L104EA29Ylg, incluyendo la muestra de sangre células leucocitos; (b) añadir CD14-FITC a la muestra de sangre; (c) añadir anticuerpos anti-receptores competitivos y no competitivos marcados a la muestra de sangre; (d) lisar la muestra de sangre y fijar leucocitos; (e) aislar leucocitos de la muestra de sangre lisada; (f) medir la expresión del receptor total y del receptor disponible de las células leucocitarias, en el que el anticuerpo antirreceptor no competitivo es 2D4, anticuerpo que es obtenible de la línea celular de hibridoma de Mus musculus, célula del bazo: 2D4, depositada con Número de Depósito ATCC PITA-7305

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para monitorizar compuestos usados para tratar enfermedades del sistema inmune tales como rechazo de injerto tras trasplante de órganos. Específicamente, la presente invención se refiere a un ensayo basado en competición de receptor CD86 basado en citometría de flujo para medir la eficiencia de unión de L104EA29Ylg a receptores CD86 comparando la unión de anticuerpos monoclonales anti-CD86 no competitivos a receptores de CD86 (expresión de CD86 total) y la unión de anticuerpos anti-CD86 competitivos a receptores de CD86 no unidos por L104EA29Ylg.

Antecedentes de la invención

La propiedad característica de un sistema immune de vertebrados es la capacidad para discriminar "lo propio" de "lo no propio" (extraño). Esta propiedad ha conducido a la evolución de un sistema que requiere múltiples señales para lograr activación inmune óptima (Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Qant. Biol. 54: 1-14 (1989)). Las interacciones células T-células B son esenciales para la respuesta inmune. Los niveles de muchas moléculas cohesivas encontradas en linfocitos T y linfocitos B se incrementan durante una respuesta inmune (Springer y col., A. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987); Shaw y Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Eds. Kindt y Long, 1: 92-97 (1988)); y Hemler Immunology Today 9: 109-113 (1988)). Los niveles aumentados de estas moléculas puede ayudar a explicar porqué las células B activadas son más eficaces estimulando proliferación de células T específicas de antígeno de lo que lo son las células B en reposo (Kaiuchi y col., J. Immunol. 131: 109-114 (1983); Kreiger y col., J. Immunol. 135: 2937-2945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141: 2907-2911 (1988); y Hawrylowicz y Unanue, J. Immunol. 141: 4083-4088 (1988)).

La generación de una respuesta inmune de linfocitos T ("células T") es un procedimiento complejo que implica interacciones célula-célula (Springer y col., A. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)), particularmente entre células T y células accesorias tales como células B y producción de los mediadores inmunitarios solubles (citocinas o linfocinas) (Dinarello y Mier, New Engl. Jour. Med. 317: 940-945 (1987)). Esta respuesta se regula por varios receptores de superficie de células T, incluyendo el complejo receptor de células T (Weiss y col., Ann. Rev. Immunol. 4: 593-619 (1986)) y otras moléculas de superficie "accesorias" (Springer y col., (1987) supra). Muchas de estas moléculas accesorias son antígenos de diferenciación de superficie celular (CD) que se dan en la naturaleza definidos por la reactividad de anticuerpos monoclonales sobre la superficie de células (McMichael. Ed, Leukocyte Typing III. Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).

Con el fin de lograr activación de linfocitos T efectiva, dos receptores sobre la superficie celular deben unirse por sus respectivos ligandos y deben suministrar una señal a la célula. Primero el receptor de linfocitos T debe reconocer al antígeno en el contexto de MHC sobre una célula presentadora de antígeno. Segundo, a receptor co-estimulador debe unirse al ligando, o co-receptor, apropiado, en la célula presentadora de antígeno. El receptor coestimulador de células T más estudiado es CD28, que se une a moléculas B7 (CD80 y CD86) en células de presentación de antígenos. Green JL, Leytze GM, Emswiler J, Peach R, Bajorath J, Cosand W, Linsley PS. Covalent dimerization of CD28/CTLA-4 and oligomerization of CD80/CD86 regulate T cell costimulatory interactions. J. of Biol. Chem. 271:26762-26771, 1994. La inhibición de la ruta de CD28/B7 in vitro inhibe proliferación de células T, producción de citocinas e induce no responsividad de las células T específica de antígeno. Green JL, Leytze GM, Emswiler J, Peach R, Bajorath J, Cosand W, Linsley PS. Covalent dimerization of CD28/CTLA-4 and oligomerization of CD80/CD86 regulate T cell costimulatory interactions. J. of Biol. Chem. 271: 26762-26771, 1994; y Kelly S, Linsley P, Warner G, Shyu WC y Paborji M. Investigator Brochure, BMS-188667, CTLA4lg. En modelos animales, esta ruta ha mostrado ser importante en respuestas inmunes dependientes de células T, incluyendo reconocimiento y autoinmunidad aloantigénica. Green JL, Leytze GM, Emswiler J, Peach R, Bajorath J, Cosand W, Linsley PS. Covalent dimerization of CD28/CTLA- 4 and oligomerization of CD80/CD86 regulate T cell costimulatory interactions. J. of Biol. Chem. 271: 26762-26771, 1994; y Kelly S, Linsley P, Warner G, Shyu WC y Paborji M. Investigator Brochure, BMS-188667, CTLA4lg. Larsen, C.P, Pearson, T.C, Adams, A.B, Tso, P, Shirasugi, N, Strobert, E, Anderson, D, Cowan, S, Price, K, Naemura, J, Emswiler, J, Greene, J, Turk, L, Bajorath, J, Townsend, R, Hagerty, D, Linsley, P.S, y R. J. Peach. 2005. Rational Development of LEA29Y, a High-Affinity Variant of CTLA4-lg with Potent Immunosuppressive Properties. American Journal of Transplantation. 5(3):443-53. Así, la ruta CD28/B7 representa una diana lógica, viable para un agente terapéutico inmunomodulador.

CTLA4lg (BMS-188667), una proteína de condensación que comprende el dominio extracelular de CTLA-4 humano (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos) y un fragmento del dominio Fc de IgGI humana, bloquea la ruta CD28B7 uniéndose a COSO y CD86 sobre la superficie de las células presentadoras de antígenos. Este compuesto se ha encontrado que es clínicamente útil como un inmunosupresor. Véase la Solicitud De Patente de los Estados Unidos 10/419,008 (Publicación N.º 20040022787 A1) que describe y discute CTLA4lg y L104EA29Ylg y los procedimientos de preparación y uso de las mismas. Documentos de Patente de los Estados Unidos Números: 5.844.095, 5.885.796, y 5.851.795 describen y discuten CTLA4lg.

Se encontró que una molécula relacionada, L104EA29Ylg (BMS-224818) (también conocida como LEA29Y), es un

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agente terapéutico inmunomodulador particularmente potente. Este compuesto es una molécula de CTLA4lg humana que contiene una sustitución de dos aminoácidos que da como resultado la unión potenciada a CD80 y CD86 en relación con CTLA4lg. Véase Larsen, C.P, Pearson, T.C., Adams, A.B., Tso, P., Shirasugi, N., Strobert, E., Anderson, D., Cowan, S., Price, K., NaemurFfia, J., Emswiler, J., Greene, J., Turk, L., Bajorath, J., Townsend, R., Hagerty, D., Linsley, P.S., and R. J. Peach. 2005. Rational Development of LEA29Y, a High-Affinity Variant of CTLA4-lg with Potent Immunosuppressive Properties. American Journal of Transplantation. 5(3):443-53. La Solicitud de Patente de Estados Unidos 09/865,321 (Publicación N.º 2002-0182211 Al) describe y discute L104EA29Ylg. EL documento WO 02/094202 informa de procedimientos para inhibir rechazo al trasplante celular de isletas, en particular para tratar diabetes, administrando moléculas mutantes de CTLA4 solubles tales como L104EA29Ylg.

El documento WO 98/19706 informa de anticuerpos específicos CD80 humanos capaces de inhibir la unión de CD80 a un receptor de CD28 sin inhibir la unión de CD80 a un receptor de CTLA4.

CD80 y CD86 se discuten en Carreno, B.M., y Collins, M., 2002 (The B7 Family of Ligants and Its Receptors: New Pathways for Costimulation and Inhibition of Immune Responses, Annu. Rev Immunol. 20: 29-53) y Salomon, B. y Bluestone, J.A., 2001 (Complexities of CD28/B7: CTLA-4 Costimulatory Pathways in Autoimmunity and Transplantation, Annu. Rev. Immunol. 19: 225-52). Dado que CTLA4lg y L104EA29Ylg se unen a leucocitos circulantes que expresan moléculas CD80 y/o CD86, sería informativo monitorizar la extensión a la que CD80 y/o CD86 está(n) unido(s) a la(s) proteína(s) de condensación, además de la cantidad de compuesto que circula en el plasma durante uso clínico. En hacer tal cosa, los trabajadores clínicos serían capaces de correlacionar niveles de exposición de compuesto con niveles de saturación de receptor requeridos para eficacia con el fin de monitorizar la eficiencia de unión. Comprender la extensión a la que CD86 está saturado con L104EA29Ylg a diversas concentraciones de sangre se puede usar para ayudar a justificar esquemas o regímenes de dosificación diferentes. Por ejemplo, durante la fase de desarrollo, se pueden utilizar diferentes formulaciones y vías de administración (por ejemplo tratamiento intravenoso mensual o subcutáneo semanal). Este ensayo se podría usar para ayudar a establecer la mejor vía y curso de administración que manifieste saturación máxima durante el periodo de tiempo más largo. El uso de ensayos de competición basados en FACS en caracterizar anticuerpos monoclonales para unir a epitopos de OX40L en células B activadas y células... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de ensayo in vivo o in vitro para monitorizar la eficiencia de unión de L104EA29Ylg a receptor CD86 en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de sangre de un paciente dosificado con L104EA29Ylg, incluyendo la muestra de sangre células leucocitos;

(b) añadir CD14-FITC a la muestra de sangre;

(c) añadir anticuerpos anti-receptores competitivos y no competitivos marcados a la muestra de sangre;

(d) lisar la muestra de sangre y fijar leucocitos;

(e) aislar leucocitos de la muestra de sangre lisada;

(f) medir la expresión del receptor total y del receptor disponible de las células leucocitarias,

en el que el anticuerpo antirreceptor no competitivo es 2D4, anticuerpo que es obtenible de la línea celular de hibridoma de Mus musculus, célula del bazo: 2D4, depositada con Número de Depósito ATCC PITA-7305.

2. El ensayo de la Reivindicación 1, que comprende adicionalmente detectar la presencia de anticuerpos usando citometría de flujo.

3. El ensayo de la Reivindicación 1, subsiguiente a la etapa (a) y antes de la etapa (b) que comprende adicionalmente la etapa (a ') de bloqueo de la unión no específica mediada por receptor de Fc.

4. El ensayo de la Reivindicación 3, en el que la unión no específica mediada por receptor de Fc está bloqueada por la adición de IgG de ratón mezclada a la muestra de sangre.

5. El ensayo de la Reivindicación 1, en el que la eficiencia de unión de L104EA29Ylg se mide comparando receptores unidos y no unidos para determinar el porcentaje de saturación de receptor por L104EA29Ylg.

6. El ensayo de la Reivindicación 1, que comprende las etapas de

(a) proporcionar una muestra de sangre de un paciente dosificado con L104EA29Ylg; (a ') añadir una mezcla de IgG de ratón a alícuotas de la muestra de sangre;

(b) añadir anti-CD14 humano-FITC a las alícuotas;

(c) añadir anticuerpos de receptor competitivos y no competitivos para separar alícuotas de la muestra de sangre;

(c ') añadir anticuerpo monoclonal anti-receptor CD86 humano no marcado en exceso a un subgrupo de muestras relevantes;

(d) lisar las alícuotas de muestra de sangre y fijar leucocitos;

(e) aislar los leucocitos de las alícuotas de muestra de sangre lisada;

(f) medir la expresión de receptor total y de receptor disponible de las células leucocitarias,

en las que el anticuerpo anti-receptor no competitivo es 2D4, anticuerpo que es obtenible a partir de línea celular de hibridoma Mus musculus, célula del bazo: 2D4, depositada con el Número de Depósito en ATCC PTA-7305.

7. Un anticuerpo 2D4, obtenible a partir de línea celular de hibridoma de Mus musculus, célula del bazo: 2D4, depositada con el Número de Depósito en ATCC PTA-7305.

8. Una línea celular de hibridoma de Mus musculus, célula del bazo: 2D4, depositada con Número de Depósito en ATCC PTA-7305, que produce el anticuerpo 2D4.