DISPOSITIVO Y PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO AUTOMÁTICO Y LA PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE MATERIALES DE PARTIDA COMPLEJOS DISCRECIONALES.

Unidad de reacción que comprende una parte inferior y una superior para el pipeteado de líquidos,

caracterizada porque la parte inferior está constituida por una cavidad de reacción con un inserto de rejilla de filtración permeable y la parte superior representa una cavidad de reacción que puede fijarse a la parte inferior y contiene una entalladura o una camisa para la recepción de un imán

Es objeto de la invención un dispositivo y un procedimiento para el aislamiento automático de ácidos nucleicos a partir de materiales de partida lo más variados posibles que contienen ácidos nucleicos que tanto garantiza una calidad muy alta de los ácidos nucleicos que van a aislarse como también hace posible el aislamiento de rendimientos cuantitativos.

El aislamiento de ADN de células y tejidos se realiza bajo condiciones clásicas dado que los materiales de partida que contienen ácidos nucleicos son digeridos bajo condiciones fuertemente desnaturalizantes y reductoras, usando también parcialmente enzimas degradadoras de proteínas, las fracciones de ácidos nucleicos liberadas se purifican mediante etapas de extracción en fenol/cloroformo y los ácidos nucleicos se obtienen de la fase acuosa mediante diálisis o precipitación en etanol (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, CSH, “Molecular Cloning”).

Estos “procedimientos clásicos” para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células y especialmente a partir de tejidos requieren mucho tiempo (en parte más de 48 h), requieren un gasto de aparatos considerable y además tampoco pueden realizarse bajo condiciones de campo. Además, tales procedimientos son peligrosos para la salud debido a los productos químicos usados como fenol y cloroformo en una cantidad significativa.

Distintos procedimientos alternativos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diferentes materiales de partida biológicos permiten evitar la costosa y peligrosa para la salud extracción en fenol/cloroformo de ácidos nucleicos, así como alcanzar una reducción de los costes de tiempo.

Todos estos procedimientos se basan en un procedimiento desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El procedimiento combina la resolución de la agarosa que contienen las bandas de ADN que van a aislarse en una disolución saturada de una sal caotrópica (NaI) con una unión del ADN a partículas de vidrio. El ADN unido a las partículas de vidrio se lava a continuación con una disolución de lavado (Tris HCl 20 mM [pH 7,2]; NaCl 200 mM; EDTA 2 mM; 50% v/v de etanol) y después se separa de las partículas de soporte.

Hasta la fecha, este procedimiento ha experimentado una serie de modificaciones y actualmente se usa para diferentes procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos de fuentes diferentes (Marko, M.A., Chipperfield, R. y Bimboim, H.G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).

Además, actualmente también existe mundialmente una pluralidad de sistemas de reactivos, sobre todo para la purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y para el aislamiento de ADN de plásmido a partir de lisados bacterianos, pero también para el aislamiento de ácidos nucleicos de cadenas más largas (ADN genómico, ARN total celular) de sangre, tejidos o también cultivos celulares.

Todos estos kits comercialmente disponibles se basan en el principio suficientemente conocido de la unión de ácidos nucleicos a soportes minerales en presencia de disoluciones de diferentes sales caotrópicas y como materiales de soporte usan suspensiones de polvo de vidrio finamente molido (por ejemplo, Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), tierras de diatomeas (empresa Sigma) o también geles de sílice (Diagen, documento DE 41 39 664 A1).

Un procedimiento practicable para una pluralidad de diferentes aplicaciones para el aislamiento de ácidos nucleicos se describe en el documento US 5.234.809 (Boom). Allí se describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales de partida que contienen ácidos nucleicos mediante la incubación del material de partida con un tampón caotrópico y una fase sólida que se une a ADN. Los tampones caotrópicos realizan tanto la lisis del material de partida como también la unión de los ácidos nucleicos a la fase sólida. El procedimiento es muy adecuado para aislar ácidos nucleicos de pequeñas cantidades de muestra y encuentra su aplicación práctica especialmente en el sector del aislamiento de ácidos nucleicos víricos.

Modificaciones específicas de estos procedimientos se refieren a la utilización de novedosos materiales de soporte que muestran ventajas de aplicación para determinados problemas (documento WO-A 95/34569).

En las memorias de patente más nuevas se da a conocer que para la adsorción de ácidos nucleicos a los materiales de silicato conocidos y utilizados por el experto también pueden utilizarse muy eficientemente y satisfactoriamente las llamadas sales anticaotrópicas como constituyente de sistemas de tampón de lisis/de unión (documento EP 1135479).

**(Ver fórmula)**

Al estado de la técnica también pertenece la memoria de patente de EE.UU. 6.207.445 B1 en la que se describe un dispositivo de filtración y extracción sencillo de utilizar para un fluido biológico que pone una muestra directamente a disposición de un procedimiento analítico. El dispositivo es capaz de poner un líquido clarificado directamente a disposición para un análisis o para una evacuación como es adecuado para el analito específico de interés, y es capaz de capturar materiales particulados y permite un procesamiento posterior, es decir, una extracción de estas partículas directamente con el dispositivo. Tan pronto como se ha extraído una vez, el dispositivo pone un líquido que contiene los analitos de interés a disposición de un procedimiento analítico. El dispositivo comprende un cuerpo flexible con un extremo superior abierto y una pared interna que define una cámara interna. Está dispuesto un mecanismo de cierre o de sellado para sellar el extremo superior abierto del cuerpo. Una disposición de filtro de gradiente que contiene al menos un filtro es soportado en el cuerpo mediante una disposición de soporte. El cuerpo flexible está dispuesto de forma que cuando es presionado por el dedo de un usuario genera una presión positiva en la cámara que es suficiente para hacer que un líquido fluya en la cámara por la disposición de filtro.

En la patente de EE.UU. 6.207.463 se describe un dispositivo para separar partículas magnéticas de una composición de sustancias. Este dispositivo contiene una envoltura protectora longitudinalmente extendida con un extremo superior y uno inferior, una zona interna rodeada por la envoltura protectora que se extiende desde su extremo superior hasta su extremo inferior, una barra magnética ajustable que está dispuesta en la zona interna, orientada en su dirección longitudinal.

En la solicitud de patente internacional WO2005/063831 A1 se describe un dispositivo para separar y purificar una suspensión con partículas magnéticas. Este dispositivo comprende un área de proceso con mecanismos que se mueven sincrónicamente para el transporte de las micropartículas magnéticas en la dirección x.

El análisis del estado de la técnica ilustra impresionantemente que existe una pluralidad de posibilidades para unir ácidos nucleicos a materiales de soporte sólidos, especialmente materiales de soporte minerales basados en silicio, lavarlos a continuación y desprender de nuevo los ácidos nucleicos del material de soporte.

Basándose en las tecnologías descritas para la unión de ácidos nucleicos a materiales de soporte sólidos existe una pluralidad de productos comercialmente disponibles que permiten al usuario aislar ácidos nucleicos de materiales de partida que contienen ácidos nucleicos. A este respecto son cada vez más interesantes las soluciones de procedimiento que permiten aislar y purificar de forma automatizada ácidos nucleicos. Esto se basa en reducir el considerable gasto manual o también en poder realizar altos rendimientos de extracciones de ácidos nucleicos. Estos requisitos tienen en cuenta que existen soluciones basadas en robots o máquinas para el aislamiento de ácidos nucleicos. A este respecto se trata generalmente de configuraciones de aparatos muy costosas que hacen posible un aislamiento de ácidos nucleicos. Generalmente pueden diferenciarse dos configuraciones de sistemas.

1. Procedimientos automatizados para aislar ácidos nucleicos utilizando placas de filtración de 96 pocillos para la unión de los ácidos nucleicos.

2. Procedimientos automatizados para aislar ácidos nucleicos utilizando partículas magnéticas para la unión de los ácidos nucleicos.

El proceso de aislamiento... [Seguir leyendo]

1. Unidad de reacción que comprende una parte inferior y una superior para el pipeteado de líquidos, caracterizada porque la parte inferior está constituida por una cavidad de reacción con un inserto de rejilla de filtración permeable y la parte superior representa una cavidad de reacción que puede fijarse a la parte inferior y contiene una entalladura o una camisa para la recepción de un imán.

2. Unidad de reacción según la reivindicación 1, caracterizada porque la parte inferior representa una punta de pipeta y la parte superior contiene un filtro para la protección de aerosoles.

3. Unidad de reacción según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque sobre rejilla de filtración se encuentra un material de soporte para la unión de biomoléculas.

4. Unidad de reacción según la reivindicación 3, caracterizada porque como material de soporte se usa una tela de fibra de vidrio, una membrana o un material de filtro cromatográfico.

5. Unidad de reacción según la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque el material de soporte está fijado al inserto de rejilla de filtración mediante la colocación de la parte superior sobre la parte inferior.

6. Máquina que contiene al menos una unidad de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Máquina según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de una máquina de extracción.

8. Máquina según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de un aparato de mesa que contiene una cinemática con cuatro grados de libertad, además de un cabezal dosificador de preferiblemente 12 canales y una bandeja de carga manual, así como adicionalmente contiene un dispositivo de aire aspirado o a presión.

9. Máquina de extracción según la reivindicación 8, caracterizada porque el dispositivo de aire aspirado o a presión está acoplado a un cabezal dispensador que está adaptado exactamente a la unidad de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Máquina de extracción según la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque la unidad de aire a presión contiene una fuente de calor.

11. Máquina de extracción según la reivindicación 8, caracterizada porque en el cabezal dispensador se encuentra una unidad cinemática para el movimiento vertical de imanes.

12. Máquina de extracción según una de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada porque contiene una interfaz para la comunicación con un ordenador que controla los procesos.

13. Procedimiento para aislar y purificar ácidos nucleicos de materiales de partida complejos discrecionales usando la unidad de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5 y/o la máquina de extracción según una de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado por las siguientes etapas:

- lisis del material de partida

- unión de los ácidos nucleicos a partículas magnéticas y dado el caso filtración de componentes sin disolver

- lavado de los ácidos nucleicos unidos / secado

- elución de los ácidos nucleicos unidos.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque antes de la lisis del material de partida, los recipientes de reacción se llenan con tampones de recipientes de almacenamiento usando la unidad de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el llenado se realiza de forma que siempre se parte de una disolución con la menor concentración de sal.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el llenado se realiza en el orden eluyente - tampón de lavado - tampón de lisis.

17. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la lisis de la muestra se realiza mediante pipeteado arriba y abajo continuo repetido de la preparación de lisis mediante la unidad de reacción.

18. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque después de la lisis se realiza la recepción del tampón de unión y las partículas magnéticas mediante la unidad de reacción y la transferencia del tampón de unión y de las partículas magnéticas a la preparación de lisis.

19. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la preparación de tampón de lisis/de unión y las partículas magnéticas se mezclan mediante la unidad de reacción mediante pipeteado arriba y abajo.

20. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la unión del ácido nucleico a las partículas magnéticas y la posterior filtración de sustancias sin disolver, así como la separación magnética, se realiza mediante las siguientes etapas se:

**(Ver fórmula)**

- aspiración de la muestra desde la parte inferior de la unidad de reacción por la rejilla de filtración a la parte superior de la unidad de reacción

- introducción de un imán del cabezal dispensador en la camisa o entalladura de la parte superior de la unidad de reacción

- devolución del líquido de muestra (sin los ácidos nucleicos unidos a las partículas magnéticas) a un recipiente de partida.

21. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el lavado del ácido nucleico unido a las partículas magnéticas se realiza mediante las siguientes etapas:

- transferencia de la unidad de reacción a la siguiente fila de recipientes de reacción (con tampones de lavado contenidos)

- inmersión de la unidad de reacción en el recipiente de reacción con tampón de lavado y aspiración del tampón de lavado hasta la parte superior de la unidad de reacción

- eliminación del imán

- repetición varias veces de las dos últimas etapas.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque la transferencia puede realizarse tanto mediante un movimiento escalonado del cabezal dispensador como mediante el movimiento escalonado de los recipientes de reacción.

23. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el secado del ácido nucleico unido a las partículas magnéticas se realiza mediante las siguientes etapas:

- transferencia de la unidad de reacción a un recipiente de reacción vacío

- aplicación de aire a presión / dado el caso calentamiento

- circulación del aire por las partículas magnéticamente fijadas a la camisa o entalladura.

24. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la elución del ácido nucleico unido se realiza mediante las siguientes etapas:

- transferencia de la unidad de dispensación con la unidad de reacción a la siguiente fila de recipientes de reacción (con tampón de elución contenido) o transferencia de la siguiente fila de recipientes de reacción al cabezal dispensador inmóvil

- inmersión reiterada de la unidad de reacción en el recipiente de reacción con tampón de elución y aspiración del tampón de elución en la parte superior de la unidad de reacción

- sacar el imán

- aspiración y expulsión recíproca (dado el caso varias veces) del tampón de elución

- repetición de las dos últimas etapas.

25. Procedimiento para el aislamiento simultáneo selectivo de ADN genómico de ARN celular a partir de materiales de partida complejos discrecionales usando la unidad de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5 y/o máquinas de extracción según una de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado por las siguientes etapas:

- lisis del material de partida

- aislamiento del ADN genómico

- aislamiento del ARN.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque la lisis del material de partida se realiza mediante pipeteado arriba y abajo continuo repetido de la preparación de lisis mediante la unidad de reacción y sobre el inserto de filtración se encuentra una tela de fibra de vidrio o una membrana o un material de filtro cromatográfico.

27. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque el aislamiento del ADN genómico se realiza mediante las siguientes etapas:

- unión del ADN genómico al material de filtro de la unidad de reacción mediante aspiración y expulsión recíproca reiterada de la muestra desde la parte inferior de la unidad de reacción por el filtro a la parte superior de la unidad de reacción

- devolución del lisado con el ARN ahora sólo incluido al recipiente de reacción

- lavado del ADN unido al filtro, realizándose la transferencia de la unidad de reacción a la siguiente fila de recipientes de reacción (con tampones de lavado contenidos)

- inmersión reiterada de la unidad de reacción en el recipiente de reacción con tampón de lavado y

pase (varias veces) del tampón de lavado mediante aspiración y expulsión recíproca (dado el caso varias veces) del tampón de lavado desde la parte inferior de la unidad de reacción por el filtro a la parte superior de la unidad de reacción

- devolución del tampón de lavado al recipiente de reacción

- secado del filtro mediante la aplicación de aire a presión (dado el caso calentado), encontrándose la unidad de reacción sobre un recipiente de reacción vacío

- elución del ADN unido mediante inmersión de la unidad de reacción en el recipiente de reacción con tampón de elución y aspiración y expulsión recíproca (dado el caso varias veces) del tampón de elución desde la parte inferior de la unidad de reacción por el filtro en la parte superior de la unidad de reacción, realizándose la transferencia de la unidad de reacción a la siguiente fila de recipientes de reacción (con tampón de elución contenido).

**(Ver fórmula)**

28. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque el aislamiento del ARN se realiza mediante las siguientes etapas:

- ajuste de las condiciones de unión óptimas para ARN

- adición de un tampón de unión alcohólico y de partículas magnéticas en la preparación de lisis restante

- pipeteado con la unidad de reacción según la invención, realizándose la mezcla de la preparación de tampón de lisis / de unión y de las partículas magnéticas con la unidad de reacción (mediante pipeteado arriba y abajo)

- unión del ARN a las partículas magnéticas mediante aspiración de la muestra desde la parte inferior de la unidad de reacción a la parte superior de la unidad de reacción

- separación magnética mediante la introducción de un imán del cabezal dispensador en la camisa o entalladura de la parte superior de la unidad de reacción

- devolución de la muestra sin el ARN unido al recipiente de partida

- lavado, secado y elución del ARN unido a las partículas magnéticas análogamente a las reivindicaciones 21 a 24.

29. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 25, caracterizado porque todas las etapas de procedimiento transcurren según el principio “Walk-Away” (continuación).

30. Uso de la unidad de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5 y/o máquinas de extracción según una de las reivindicaciones 7 a 12 para a) una dispensación y pipeteado exactos de líquidos y/o b) una separación de componentes sin disolver sólidos después de la lisis de una muestra que va a procesarse y/o c) el aislamiento de ácidos nucleicos usando partículas magnéticas y/o d) el aislamiento de ácidos nucleicos mediante su unión cromatográfica a un material de soporte sólido.