Procedimiento de detección y/o de identificación de bacterias presentes en una muestra,

líquida o sólida, caracterizado por que:

a. en un primer recipiente (1), la muestra, que puede contener dichas bacterias, se pone en un medio de cultivo líquido (2)

b. se proporciona un segundo recipiente (4) que comprende al menos un sistema de detección (6) de dichas bacterias,

c. se proporciona un medio de transferencia (3) entre el primer recipiente (1) y el segundo recipiente (4), comprendiendo dicho medio de transferencia (3) al menos una primera abertura (7) a nivel del primer recipiente (1) y al menos una segunda abertura (8) a nivel del segundo recipiente (4), de tal manera que el segundo recipiente (4) circunscribe un primer volumen de aire (9) entre la abertura (8) del medio de transferencia (3) y el sistema de detección (6) de dichas bacterias,

d. se aplica una temperatura T1 en el interior del segundo recipiente (4) y después,

e. se aplica una temperatura T2 en el interior del segundo recipiente (4)

f. la temperatura T1 es superior a la temperatura T2 de tal manera que se transfiere un volumen definido del medio de cultivo (2) del primer recipiente (1) al segundo recipiente (4),

g. se determina la presencia o ausencia de bacterias y/o se identifican las bacterias a nivel del sistema de detección (6).

Procedimiento y dispositivo de detección y/o de identificación de bacterias presentes en una muestra La presente invención se refiere a un procedimiento de detección y/o de identificación de bacterias presentes en una muestra, líquida o sólida. La invención también se refiere a un dispositivo de detección y/o de identificación de bacterias presentes en dicha muestra.

La identificación de bacterias en alimentos, es indispensable para la sanidad pública. Por ejemplo, las bacterias del genero Salmonella, que pueden encontrarse en una gran cantidad de alimentos, son la causa de numerosas patologías en el ser humano (fiebre tifoidea, intoxicación alimentaria) . De hecho, el aislamiento y la identificación de la bacteria Listeria es un requisito principal de la supervisión de la higiene agroalimentaria y la bacteriología médica. Así, entre las bacterias del genero Listeria, la especie Listeria monocytogenes, conocida por ser un patógeno para el hombre puede producir listeriosis, a veces mortal (del 25 al 30 % de los casos) en personas inmunosuprimidas y en niños pequeños. Es por tanto muy importante disponer de un ensayo fiable y rápido que permita detectar la contaminación por estas bacterias, ensayo que debe ser, al mismo tiempo, sensible y especifico. Por último, la identificación de las bacterias del género Staphylococcus es también primordial. La mayoría de estas especies son patógenos oportunistas en el hombre y presentan un riesgo elevado en caso de lesión cutánea por un traumatismo o por un implante directo de un producto médico. Por otra parte, la especie Staphylococcus aureus es una bacteria que se encuentra a menudo en pacientes que deben recibir cuidados hospitalarios en los que intervienen aparatos tales como jeringas o catéteres. Existe por tanto un gran interés para detectar la presencia de esta bacteria patógena, cada vez más implicada en enfermedades nocosomiales.

Actualmente existen numerosos ensayos de detección de bacterias. De manera general, estos ensayos de detección requieren un pre-enriquecimiento que comprende:

o una etapa de resurrección, que permite a las bacterias recuperar el estrés inducido por el cultivo y

o una etapa de crecimiento exponencial bacteriano, que es indispensable cuando pocas especies están inicialmente presentes en la muestra y

o una etapa de detección de bacterias, que debe realizarse preferencialmente en el valor máximo de crecimiento bacteriano, y antes de la aparición de la fase de muerte bacteriana, que se observa durante cualquier cultivo bacteriano.

A título indicativo del método de detección de bacterias, puede citarse el procedimiento de detección de Salmonella descrito en la Patente US-A- 4.563.418, basado en inmunoprecipitación. La detección de estas bacterias se efectúa, después de la etapa de pre-enriquecimiento y de crecimiento bacteriano, después de la migración en un medio de cultivo pre-enriquecido en Salmonella y una reacción con anticuerpos dirigidos contra la Salmonella. También puede citarse un método comparable, también basado en inmunoprecipitación, que se presenta en la Patente US-A

5.432.229. Sin embargo, en estos métodos, el usuario debe realizar manualmente una etapa de transferencia del medio de cultivo, pre-enriquecido en bacterias, hacia el gel de migración, lo que puede inducir a problemas, particularmente de contaminación, pero también riesgos para la sanidad del manipulador.

También pueden citarse métodos más recientes, basados principalmente en la migración de bacterias a través de un medio selectivo de la especie de bacterias que se desea detectar específicamente. De esta manera, la solicitud de Patente EP-A- 0259116 presenta un procedimiento para detectar la presencia de Salmonella en una muestra, comprendiendo el procedimiento la migración de las Salmonellas presentes en un medio de cultivo pre-enriquecido hacia un medio selectivo, especifico de salmonellas. Las salmonellas migran entonces hacia el sistema de detección, permitiendo su identificación, mientras que el medio selectivo detiene al resto de bacterias que pueden estar presentes en la muestra. Sin embargo, en este procedimiento, el medio de cultivo permanece en contacto con el medio selectivo y el sistema de detección, lo que constituye el problema principal de este tipo de procedimiento. De esta manera, si la muestra está muy contaminada, las bacterias, distintas de las salmonellas presentes en el medio de cultivo, pueden entonces saturar al medio selectivo, no realizando más su función de barrera selectiva. La presencia de bacterias, distintas de las salmonellas, en el sistema de detección puede entonces constituir un positivo falso: se detecta un sistema de detección positivo mientras que la muestra no está contaminada por salmonellas. Además, el procedimiento tal y como se describe en esta solicitud, solo puede aplicarse para las bacterias móviles.

La presente invención se propone resolver el conjunto de inconvenientes del estado de la técnica presentando particularmente un procedimiento para la detección y/o identificación de bacterias, que apenas requiere manipulación, por parte del manipulador, del medio de cultivo que comprende las bacterias, permitiendo un diagnóstico rápido, directamente desde el medio de cultivo, que puede realizarse fácilmente durante la fase de crecimiento exponencial bacteriano.

Antes de continuar, las siguientes definiciones permitirán comprender mejor la siguiente exposición de la invención.

Por muestra, se entiende una muestra alimentaria, obtenida de cualquier tipo de alimento, pero también una muestra clínica, obtenida de una extracción de fluido biológico. Esta muestra puede ser líquida o sólida y puede citarse, de manera no limitativa, una muestra alimentaria de agua, de bebidas tales como leche, zumo de frutas; una muestra clínica de sangre, plasma, orina, heces, una muestra alimentaria de yogur, carne, huevos, legumbres, mayonesa, queso; pescado…, una muestra alimentaria obtenida de una alimentación destinada a animales, tal como particularmente una muestra obtenida de harinas animales.

Por primer recipiente, se entiende cualquier tipo de contenedor que pueda recibir un medio de cultivo, tal como particularmente un matraz, un frasco, una bolsa Stomacher®… Puede ser ventajoso que este primer recipiente tolere una variación de presión, en particular una variación de temperatura. De esta manera, si el primer recipiente está fabricado de un material sólido (tal como un frasco de vidrio) , es ventajoso que este primer recipiente esté abierto, o esté provisto de una válvula que permita una variación de presión. Cuando el primer recipiente está fabricado de un material flexible, tal como particularmente, una bolsa Stomacher®, puede estar abierto o cerrado, ya que, debido a la flexibilidad del material, se permite la variación de presión.

Por medio de cultivo, se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la viabilidad y el crecimiento de las células. El experto en la materia conoce bien dicho medio de cultivo y podrá seleccionar fácilmente el medio de cultivo más adecuado en cuanto a las bacterias que desea detectar.

Por medio selectivo, se entiende un medio que permite seleccionar las bacterias que deben reaccionar con el sistema de detección de bacterias. Cuando se desea seleccionar, por ejemplo, una bacteria determinada, el medio selectivo comprende un antibiótico dirigido contra las otras especies bacterianas, que pueden estar presentes en la muestra y que no se quieren detectar. Otro ejemplo consistiría en que ese medio de cultivo selectivo comprenda un compuesto tóxico contra determinadas bacterias particulares. Puede utilizarse también un medio nutricionalmente restrictivo para determinadas bacterias. El experto en la materia conoce bien dichos medios selectivos y seleccionará un medio selectivo apropiado en función de la muestra y de las bacterias que desee analizar. Este medio selectivo puede estar mezclado con el medio de cultivo o aislado en un segundo recipiente que comprende el sistema de detección.

Por segundo recipiente, se entiende cualquier tipo de contenedor que pueda recibir al menos un sistema de detección tal como se define más adelante. Este segundo recipiente es preferentemente un material suficientemente rígido, de tal forma que su volumen permanece constante cuando en su interior se aplica una disminución de temperatura. Este segundo recipiente puede estar incluido en el primer recipiente para que el usuario solo disponga de un dispositivo que comprenda el conjunto de los medios necesarios para... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección y/o de identificación de bacterias presentes en una muestra, líquida o sólida, caracterizado por que:

a. en un primer recipiente (1) , la muestra, que puede contener dichas bacterias, se pone en un medio de cultivo líquido (2)

b. se proporciona un segundo recipiente (4) que comprende al menos un sistema de detección (6) de dichas bacterias,

c. se proporciona un medio de transferencia (3) entre el primer recipiente (1) y el segundo recipiente (4) , comprendiendo dicho medio de transferencia (3) al menos una primera abertura (7) a nivel del primer recipiente (1) y al menos una segunda abertura (8) a nivel del segundo recipiente (4) , de tal manera que el segundo recipiente (4) circunscribe un primer volumen de aire (9) entre la abertura (8) del medio de transferencia (3) y el sistema de detección (6) de dichas bacterias,

d. se aplica una temperatura T1 en el interior del segundo recipiente (4) y después,

e. se aplica una temperatura T2 en el interior del segundo recipiente (4)

f. la temperatura T1 es superior a la temperatura T2 de tal manera que se transfiere un volumen definido del medio de cultivo (2) del primer recipiente (1) al segundo recipiente (4) ,

g. se determina la presencia o ausencia de bacterias y/o se identifican las bacterias a nivel del sistema de detección (6) .

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que el medio de transferencia (3) circunscribe un segundo volumen de aire (16) entre la primera abertura (7) y la segunda abertura (8) .

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2 caracterizado por que T1 está comprendida entre 25 y 45 º C, preferentemente entre 30 y 42 º C.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que T2 está comprendida entre 4 y 24 º C, preferentemente entre 13 y 18 º C.

5. Procedimiento de detección y/o de identificación de bacterias presentes en una muestra, líquida o sólida,

caracterizado por que:

a. en un primer recipiente (1) , se coloca la muestra que puede contener dichas bacterias en un medio de cultivo (2) líquido,

b. se proporciona un segundo recipiente (4) que comprende al menos un sistema de detección (6) de dichas bacterias

c. se proporciona un medio de transferencia (3) entre el primer recipiente (1) y el segundo recipiente (4) , comprendiendo dicho medio de transferencia (3) al menos una primera abertura (7) a nivel del primer recipiente (1) y al menos una segunda abertura (8) a nivel del segundo recipiente (4) , de tal manera que el segundo recipiente (4) circunscribe un primer volumen de aire (9) entre la segunda abertura (8) y el sistema de detección (6) de dichas bacterias y/o el medio de transferencia (3) circunscribe un segundo volumen de aire (16) entre la primera abertura (7) y la segunda abertura (8) ,

d. se aplica una temperatura T1 en el interior del primer recipiente (1) y después,

e. se aplica una temperatura T2 en el interior del primer recipiente (1)

f. la temperatura T1 es inferior a la temperatura T2 de tal manera que se transfiere un volumen definido del medio de cultivo (2) del primer recipiente (1) al segundo recipiente (4) ,

g. se determina la presencia o ausencia de bacterias y/o se identifican las bacterias a nivel del sistema de detección (6) .

6. Dispositivo de detección y/o de identificación de bacterias en una muestra que comprende

• un primer recipiente (1) ,

• un segundo recipiente (4) , que comprende al menos un sistema de detección (6) ,

• al menos un medio de transferencia (3) entre el primer recipiente (1) y el segundo recipiente (4) , comprendiendo dicho medio de trasferencia al menos una primera abertura (7) a nivel del primer recipiente

(1) y al menos una segunda abertura (8) a nivel del segundo recipiente (4)

circunscribiendo dicho segundo recipiente un primer volumen de aire (9) entre dicho sistema de detección (6) y la segunda abertura (8) del medio de transferencia (3) .

7. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 6 caracterizado por que adicionalmente comprende un segundo volumen de aire (16) circunscrito, a nivel del medio de transferencia (3) , entre la primera abertura (7) y la segunda abertura (8) .

8. Dispositivo, de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, caracterizado por que el medio de transferencia (3) es un conducto no capilar.

9. Disposición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 caracterizado por que el segundo 5 recipiente (4) está incluido en el primer recipiente (1) .

10. Kit de detección y/o de identificación de bacterias que comprende un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.