DIOXIGENASAS RECOMBINANTES.

Dioxigenasas recombinantes.Secuencias de ácido nucleico recombinante de plantas de azafrán,

que codifica para enzimas responsables de la síntesis de apocarotenoides, que puede usarse para la regulación y manipulación del color, del sabor y del aroma en plantas, en bacterias que acumulan carotenoides o en células de levadura

Dioxigenasas recombinantes.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología, la biología molecular y la agricultura biotecnológica. Se refiere a la integración de secuencias de ácido nucleico recombinante de plantas de azafrán, que codifica para enzimas responsables de la síntesis de apocarotenoides, que puede usarse para la regulación y manipulación del color, del sabor y del aroma en plantas, en bacterias que acumulan carotenoides o en células de levadura.

Estado de la técnica anterior

Los carotenoides son una clase de pigmentos ubicuos, que consisten en más de 600 compuestos isoprenoides, mayoritariamente de 40 carbonos (C40), que contienen ocho unidades de isopreno. Pueden ser divididos en dos grupos mayoritarios: carotenos y xantofilas. Los carotenos son hidrocarbonos lineares o ciclados, tales como el licopeno, el α-caroteno y el β-caroteno, y las xantofilas son derivados oxigenados (grupos epoxi, ceto o hidroxilo) de los carotenos; por ejemplo: luteína y zeaxantina.

Los organismos capaces de sintetizar carotenoides incluyen a todas las plantas fotosintéticas, protistas y bacterias, así como a algunas bacterias heterótrofas y algunos hongos. En plantas, los carotenoides son esenciales para el desarrollo y crecimiento de la planta; las mutaciones que bloquean la acumulación de los carotenoides generan efectos pleiotrópicos sobre el desarrollo de la biogénesis del cloroplasto y el desarrollo de las semillas Los carotenoides son los pigmentos accesorios en los complejos antena del cloroplasto, donde actúan incrementando la capacidad de captación de la luz, adsorbiendo en la región azul-verde del espectro visible (450-550 nm) y transfiriendo la energía a la clorofila. Los carotenoides también participan en los procesos de fotoprotección en plantas, y poseen funciones como antioxidantes. Otras de las funciones de los carotenoides están relacionadas con su intenso color, siendo responsables de las intensas coloraciones y pigmentaciones de flores y frutos, actuando como atrayentes de polinizadores y de animales que ayuden a la dispersión de las semillas. Los carotenoides son también responsables de la pigmentación de invertebrados, aves y peces. En el caso de las aves, existe una relación directa entre pigmentación debida a carotenoides y atractivo sexual.

En plantas, la biosíntesis de los carotenoides ocurre en las membranas de los cloroplastos, cromoplastos, y amiloplastos, plástidos genéticamente idénticos pero con una arquitectura de membranas internas muy distinta, por enzimas codificadas por genes nucleares. Los carotenoides mayoritarios en los cloroplastos son el β-caroteno y las xantofilas. En los cromoplastos no fotosintéticos la composición y distribución de los pigmentos carotenoides varía de forma considerable de una especie vegetal a otra. Pero además, la composición de los compuestos carotenoides presentes en cada especie vegetal se ve alterada a su vez, por los cambios en las condiciones ambientales.

La mayoría de los carotenoides poseen esqueletos de 40 átomos de carbono, que consisten en ocho unidades de isopreno. Sin embargo, algunos carotenoides tienes esqueletos con un número inferior de 40 carbonos. La mayoría de ellos son el resultado de la degradación de uno o ambos extremos de la molécula de 40 carbonos, son los apocarotenoides o diapocarotenoides.

Los apocarotenoides actúan como señales visuales o volátiles para atraer a los organismos polinizadores y a los dispersadores de semillas. Desempeñan también funciones importantes en las interacciones aleopáticas, en las reacciones de defensa, como fitohormonas, y además actúan como señales que regulan la arquitectura de la planta. La variedad de apocarotenoides viene determinada por la elevada cantidad de los precursores carotenoides (más de 600 han sido identificados), las variaciones en el sitio de corte dentro del esqueleto, y las subsiguientes modificaciones que éste sufre tras el corte. A pesar de su importancia, se conoce poco sobre los factores que regulan su producción en plantas.

Entre los compuestos volátiles derivados de los carotenoides, los más importantes, desde el punto de vista de su explotación por parte de los humanos, se encuentran la β-ionona, α-ionona, geranilacetona (6,10-dimetil-5,9-undecadien-2-ona), pseudoionona (6,10-dimethyl-3,5,9-undecatrien-2-ona) y β-damascenona. La β-ionona, es responsable de la fragancia de muchas flores, y procede del corte oxidativo del carotenoide β-caroteno en los dobles enlaces 9,10(9',10').

Una subfamilia de dioxigenasas de ruptura de carotenoides, CCD1s (Schwartz et al., 2001), cataliza la ruptura oxidativa en las posiciones 9,10-(9',10') generando el aldehído lineal C14 y varios derivados C13 volátiles. Se ha visto que el genoma de la petunia contiene un gen que codifica para la dioxigenasa que cataliza la excisión 9,10(9',10') de los carotenoides, el PhCCD1. El PhCCD1 es idéntico en un 94% a el LeCCD1A, el enzima responsable de la formación de í3-ionona en tomate (Lycopersicon esculentum; Simkin, et al. 2004. Circadian regulation of the phccdl carotenoid cleavage dioxygenase controls emission of beta-ionone, a fragrance volatile of petunia flowers. J Plant Physiol. 136:3504-3514). En este trabajo se puso de manifiesto que la reducción de los niveles de PhCCD1 transcrito en plantas transgénicas produce un descenso de entre un 56 y un 76% de la síntesis de β-ionona en las corolas de las líneas de petunia seleccionadas, lo que indica el rol significativo de esta enzima en la síntesis de volátiles. El análisis cuantitativo mediante PCR-transcriptasa inversa reveló que PhCCD1 se expresa en grandes cantidades en corolas y hojas, donde constituye aproximadamente el 0.04% y el 0.02% del RNA total, respectivamente. PhCCD1 es inducible por la luz y exhibe un ritmo circadiano tanto en hojas como en flores. La emisión de b ionona por las flores ocurre principalmente durante las horas diurnas, paralelamente a la expresión de PhCCD1 en corolas. Estos resultados indican que la actividad de PhCCD1 y la emisión de β-ionona están reguladas a nivel de los tránscritos.

La escisión enzimática oxidativa de los carotenoides tiene lugar en bacterias y plantas, y se puede citar por ejemplo la formación de azafrán en Crocus sativus, citraurin y otros apocarotenoides en los frutos cítricos y, la formación del ácido abscísico (ABA), una hormona implicada en la regulación del crecimiento, como por ejemplo en la caída de las hojas en otoño y en la latencia de las semillas. (ABA deriva de la escisión oxidativa de los 9-cis-epoxicarotenoides en el doble enlace 11-12). También interviene en la formación del ácido retinoico. Estas reacciones están catalizadas por una familia de proteínas denominadas genéricamente "dioxigenasas de corte de carotenoides" (CCDs). Estas enzimas parecen tener una elevada especificidad en cuanto al punto de corte, catalizando la ruptura en el enlace 9-10 en las que se han aislado de Arabidopsis, azafrán, tomate, uva y melón (Schwartz et al. 2001. Characterization of a novel carotenoid cleavage dioxygenase from plants. J Biol Chem 276, 25208-25211; Simkin et al. 2004a The tomato carotenoid cleavage dioxygenase 1 genes contribute to the formation of the flavor volatiles beta-ionone, pseudoionone, and geranylacetone. Plant J. 40, 882-892; Mathieu et al. 2005 A Carotenoid Cleavage Dioxygenase from Vitis vinifera L.: functional characterization and expression during grape berry development in relation to C13-norisoprenoid accumulation. J. Exp. Bot. 56, 2721-2731; Ibdah et al. 2006 Functional characterization of CmCCD1, a carotenoid cleavage dioxygenase from melon. Phytochem. 67, 1579-1589). En azafrán también se ha caracterizado una CCDs con punto de corte en los enlaces 7-8 y 7'-8' que utiliza zeaxantina como sustrato, y de Bixa orellana se ha aislado una CCD que cataliza el corte del licopeno en las posiciones 5-6 y 5'-6'(Bouvier et al. 2003. Oxidative remodelling of chromoplast carotenoids: identification of a carotenoid cleavage dioxygenase CsCCD and CsZCD genes involved in Crocus secondary metabolic biogenesis. Plant Cell 15: 47-62).

El reciente desarrollo de la biotecnología y la aplicación de varios procesos de transferencia génica a las plantas cultivadas han impulsado enormemente la industria de la floricultura y la horticultura en los últimos años. Sin embargo, el aún escaso conocimiento...

1. Polinucleótido aislado que codifica un péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

2. Polinucleótido aislado que codifica un péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2.

3. Uso del polinucleótido aislado que codifica un péptido que comprende una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 70% con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 2, para potenciar el sabor y/o el aroma de las plantas.

4. Uso del polinucleótido aislado según la reivindicación anterior, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 2.

5. Uso del polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 90% con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 2.

6. Uso del polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 95% con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 2.

7. Uso del polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 2.

8. Uso del polinucleótido aislado que codifica un péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 2, para potenciar el sabor y/o el aroma de las plantas.

9. Construcción genética que comprende:

a. un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8,

b. moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, erativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés.

10. Construcción genética según la reivindicación anterior, para su uso en la potenciación del sabor y aroma en las plantas.

11. Método para potenciar el sabor y/o el aroma de las plantas que comprende:

a. introducir una construcción genética según la reivindicación 8 en una célula hospedante,

b. crecer la célula hospedante según a. en un medio adecuado.