DIAGNÓSTICO Y MONITORIZACIÓN DEL LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Y DE LA ESCRERODERMIA.

Un procedimiento de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo,

que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico o con la cantidad de dicho componente conocido por estar presente sobre la superficie de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia

INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE

Algunos trabajos descritos en la presente invención han sido amparados por la Ayuda No. N01AR92239 entre el NIH y la University of Pittsburgh. El Gobierno puede tener ciertos derechos en la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a la diagnosis y/o monitorización de pacientes con lupus eritematoso sistémico o esclerodermia, incluyendo procedimientos para llevar a cabo esta actividad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a la diagnosis y/o monitorización de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) y con esclerosis sistémica (esclerodermia). La invención proporciona igualmente medios para distinguir entre las dos enfermedades y ayuda a los doctores a distinguir el SLE y la esclerodermia de otras enfermedades.

El lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus es la enfermedad autoinmune prototípica que resulta de una implicación multiorgánica. Esta anti-autorespuesta se caracteriza por autoanticuerpos dirigidos contra una diversidad de componentes celulares nucleares y citoplásmicos. Estos auto-anticuerpos se unen a sus antígenos respectivos, que forman complejos inmunes los cuales circulan y eventualmente se depositan en los tejidos. Esta deposición de complejo inmune causa inflación crónica y lesión en los tejidos.

El diagnóstico y monitorización de la actividad de la enfermedad son ambas problemáticas en pacientes con SLE. La diagnosis es problemática debido a que el espectro de la enfermedad es amplio y varía desde síntomas sutiles o vagos hasta el fallo multi-orgánico con amenaza para la vida. Existen otras enfermedades con implicación mult-sistema que pueden ser confundidas con lupus eritematoso, o viceversa. Se desarrollaron criterios con el fin de clasificación de la enfermedad en 1971(Cohen, AS, y otros, “Preliminary criteria for the classification of systemic lupus erythematosus”. Bull. Rheum. Dis., vol. 21, págs. 643-648, (1971)) y se revisaron en 1982 (Tan, EM, y otros, “The 1982 revised criteria for the classifaction of systemic lupus erythematosus”. Arth. Rheum., vol. 25, págs. 1271-1277, (1982)) y en 1997 (Hochberg, MC. “Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classication of systemic lupus erythematosus”. Arth. Rheum., vol. 40, pág. 1725, (1997)). Estos criterios están pensados para asegurar que los pacientes procedentes de localizaciones geográficamente diferentes son comparables. De los once criterios, la presencia de cuatro o más, tanto seriadamente como simultáneamente, es suficiente para la clasificación de un paciente como que tiene SLE. Aunque los criterios sirven como recordatorios útiles de aquellas características que distinguen al lupus de otras enfermedades autoinmunes relacionadas, son inevitablemente falibles. La determinación de la presencia o la ausencia de los criterios requiere frecuentemente interpretación. Si se aplican normas liberales para la determinación de la presencia o la ausencia de un signo o síntoma, se podría fácilmente diagnosticar a un paciente como que tiene lupus cuando de hecho no lo tiene. De manera similar, la gama de manifestaciones clínicas en SLE es mucho más grande que la descrita mediante los once criterios y cada manifestación puede variar en cuanto al índice de actividad y de severidad de un paciente a otro. Para complicar adicionalmente una diagnosis difícil, los síntomas de SLE evolucionan continuamente en el transcurso de la enfermedad. Pueden desarrollarse con el tiempo nuevos síntomas en órganos previamente no afectados. No existe un ensayo definitivo para el lupus y, en consecuencia, frecuentemente está mal diagnosticado.

La monitorización de la actividad de la enfermedad es también problemática en cuanto el cuidado de los pacientes con lupus. El lupus progresa en una serie de reactivaciones, o periodos de enfermedad aguda, seguido de remisiones. Los síntomas de una reactivación, la cual varía considerablemente entre pacientes o incluso dentro del mismo paciente, incluyen malestar, fiebre, dolor simétrico de articulaciones, y fotosensibilidad (desarrollo de exantemas después de breve exposición al sol). Otros síntomas de lupus incluyen pérdida del cabello, úlceras de membranas mucosas e inflamación del revestimiento del corazón y pulmones lo cual conduce a dolor del pecho. Los glóbulos rojos, plaquetas y glóbulos blancos pueden ser objetivos del lupus, dando como resultado problemas de anemia y de hemorragias. Más seriamente, la deposición de complejos inmunes y la inflamación crónica en los vasos sanguíneos puede conducir a implicaciones del riñón y ocasionalmente fallos, lo cual requiere diálisis y trasplante de riñón. Puesto que el vaso sanguíneo es un objetivo fundamental de la respuesta autoinmune en el lupus, no son raros los ataques y enfermedad cardíaca prematuros. Sin embargo, con el tiempo, estas reactivaciones pueden conducir a un daño irreversible del órgano. Con el fin de minimizar dicho daño, la detección más prematura y más exacta de la reactivación de la enfermedad no solamente aceleraría el tratamiento apropiado, sino que reduciría la frecuencia de intervenciones innecesarias. Desde un punto de vista de la investigación, la capacidad para describir de manera uniforme la “extensión de la inflamación” o la actividad de la enfermedad en sistemas de órganos individuales o como una medida general, es una herramienta de investigación valor incalculable. Además, una medida de la actividad de la enfermedad puede usarse como una variable de respuesta en un ensayo terapéutico.

Dos de los instrumentos más comúnmente usados son el Indice de Actividad de la Enfermedad de Lupus Sistémico (SLEDAI) (Bombardier, C., D.D. Gladman, y otros, “Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus pacients. The Committee on Prognosis Studies in SLE”. Arth. Rheum., vol. 35, págs. 630-40, (1992)), y la Medida de la Actividad del Lupus Sitémico (SLAM) (Liang, M.H., S.A. Socher, y otros, “Reliability and validity of six systems for the clinical assesment of disease activity in systemic lupus erythematosus”, Arth. Rheum., vol. 32, págs. 1107-18, (1989)). El SLEDAI incluye 24 partidas que representan 9 sistemas de órganos. Las variables se obtuvieron mediante la historia, examen físico y evaluación de laboratorio. A Cada partida se asignó un peso desde 1 hasta 8 en base a la importancia del órgano implicado. Por ejemplo, las úlceras de boca se puntuaron como 2, en tanto que las crisis se puntuaron como 8. Los parámetros de laboratorio que se incluyeron en el SLEDAI incluyen el recuento de glóbulos blancos, recuento de plaquetas, análisis de orina, suero C3, C4 y anti-ADNds. La puntuación máxima total es de 105. La SLAM incluye 32 partidas que representan 11 sistemas de órganos. Las partidas se puntuaron no solamente como presente/ausente, sino que además se graduaron en una escala de 1 a 3 en base a la severidad. La puntuación posible total para la SLAM es de 86. Tanto el SLEDAI como la SLAM han mostrado ser válidos, fiables, y sensibles al cambio a lo largo del tiempo (Liang, M.H., S.A. Socher, y otros, “Reliability and validity of six systems for the clinical assesment of disease activity in systemic lupus erythematosus”, Arth. Rheum., vol. 32, págs. 1107-18, (1989)), y son ampliamente usados en protocolos de investigación y ensayos clínicos. Estos índices son particularmente útiles para examinar el valor de marcadores serológicos o inflamatorios recientemente propuestos de la actividad de la enfermedad en SLE.

A pesar de la obvia utilidad de estos instrumentos, existen algunos inconvenientes. En primer lugar, no existe siempre una completa concordancia entre la SLAM y el SLEADI en el mismo grupo de pacientes. Existen diversas posibles razones para estas discrepancias. A diferencia del SLEDAI, la SLAM incluye síntomas atribuibles a la constitución tales como fatiga y fiebre, los cuales pueden considerarse o no como atribuibles a un SLE activo; este índice de actividad depende de la interpretación del médico. Además, el SLEDAI no captura grados suaves de actividad en algunos sistemas de órganos y no tiene descriptores para diversos tipos de actividad tales como anemia hemolítica. Por estas y otras razones, la mayoría de los estudios incorporan más de una medición de la actividad de la enfermedad.

Una revisión general del estado de la técnica puede encontrarse en Ramsey-Goldman,

R. y Manzi, S. “Systemic Lupus Erythematosus”. En: Goldman and Hatch....

1. Un procedimiento de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico o con la cantidad de dicho componente conocido por estar presente sobre la superficie de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico en el que la etapa a) comprende además la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa b) comprende además la comparación de dicha determinación con la cantidad de receptor CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico de esclerodermia, que comprende además la determinación, en la muestra de sangre del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa

(b) comprende la comparación de la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra con la relación de C4d:CR1 sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico, en el que el componente complemento C4d se determina en la etapa (a) automáticamente, y en el que en la etapa (b) la determinación se compara automáticamente con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el componente complemento C4d y el receptor complemento CR1 se determinan en la etapa (a) automáticamente, y en el que en la etapa (b) la determinación se compara automáticamente con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, depositados sobre superficies de glóbulos rojos.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico de esclerodermia, en el que el componente complemento C4d se determina en la etapa (a) automáticamente, y en el que en la etapa (b) la determinación se compara automáticamente con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico de escleroder

mia, en el que la etapa (a) comprende la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 depositados sobre superficies de los glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa (b) comprende la comparación automáticamente de dichas determinaciones con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, sobre superficies de glóbulos rojos.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la determinación de C4d se realiza mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un resto marcado, y la determinación del resto marcado.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el resto marcado es un resto fluorescente.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el resto fluorescente se determina mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la etapa (b) comprende la comparación de la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra con la relación de C4d:CR1 sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las determinaciones de C4d y CR1 se realizan mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un primer resto marcado, la unión de CR1 a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para CR1 con un segundo resto marcado, y la determinación del primer y segundo restos marcados.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que los restos marcados son restos fluorescentes.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los restos fluorescentes se determinan mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 ó 7, en el que los valores de referencia comprenden una relación de C4d:CR1.

16. Un procedimiento de monitorización de la actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico en un individuo o de monitorización de la esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de los

glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de los glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la determinación de C4d se realiza mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un resto marcado, y la determinación del primer resto marcado.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el resto marcado es un resto fluorescente.

19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el resto fluorescente se determina mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el componente complemento C4d se determina automáticamente en la etapa (a), y en el que dicha determinación se compara automáticamente con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la etapa (b).

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 de monitorización de la actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico, en el que la etapa a) comprende además la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa b) comprende demás la comparación de dicha determinación con la cantidad de receptor CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etapa (b) comprende la comparación de la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra con la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la determinación de C4d y CR1 se realiza mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un primer resto marcado, la unión de CR1 a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para CR1 con un segundo resto marcado, y la determinación del primer y segundo restos marcados.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que los restos marcados son restos fluorescentes.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que los restos flúores centes se determinan mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el componente complemento C4d y el receptor complemento CR1 se determinan automáticamente en la etapa (a), y en el que dichas determinaciones se comparan automáticamente en la etapa (b) con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, sobre superficies de glóbulos rojos.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en el que los valores de referencia comprenden una relación de C4d:CR1.

28. Uso de un medio de lectura por ordenador, comprendiendo dicho medio de lectura por ordenador:

(a) código para la recepción de datos correspondientes a una determinación del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos;

(b) código para la recuperación de un valor de referencia para el componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos;

(c) código para la comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b), en el que dicha comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b) proporciona información relativa a si un paciente tiene lupus eritematoso sistémico o esclerodermia, en un procedimiento para el diagnóstico o la monitorización del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de dicha determinación con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos, en el que los códigos (a) a (c) son ejecutados sobre un ordenador digital.

29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el medio de lectura por ordenador, comprende además:

(d) código para la recepción de datos correspondiente a una determinación del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos;

(e) código para la recuperación de un intervalo de valores de referencia para el receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos; y

(f) código para la comparación de los datos en (d) con los valores de referencia de (e), en el que dichos códigos (d) a (f) son también ejecutados sobre dicho ordenador digital.