PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR UNA SUBSTANCIA DIANA MEDIANTE RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR.

Procedimiento para detectar una substancia diana mediante resonancia magnética nuclear. Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar una substancia diana en una muestra mediante resonancia magnética nuclear. Antecedentes de la invención La espectroscopia por resonancia magnética nuclear es una técnica bien conocida que se aplica de forma extensible para análisis cuantitativos y cualitativos de una gran variedad de muestras. La técnica generalmente comprende la grabación de un espectro de resonancia magnética nuclear, de ahora en adelante denominado espectro RMN, bajo condiciones que sean selectivas para un isótopo nuclear preseleccionado con un momento angular de giro diferente a 0, tal como 1 H, 13 C o muchos otros. En general, un espectro RMN obtenido a partir de una muestra que contiene una especie molecular comprende una pluralidad de picos de señales que resultan de los núcleos del isótopo preseleccionado. Cada pico de señal se corresponde con una frecuencia de resonancia particular que es atribuible a uno o varios núcleos que experimentan un campo magnético local particular como consecuencia del entorno molecular particular. Consecuentemente, la frecuencia de resonancia a la cual se observa un pico de señal RMN, habitualmente expresada en téIRMnos del denominado desplazamiento químico dado en partes por millón (ppm) con respecto a una señal de referencia, es inicialmente una indicación de la ubicación molecular del núcleo o de los núcleos que producen la señal pico, pero también depende de condiciones de la muestra tales como el valor del pH, el contenido de sal, etc. Una ventaja importante de la espectroscopía por RMN en comparación con muchas otras técnicas analíticas descansa en el hecho de que bajo ciertas condiciones bien conocidas la integral de un pico de señal es directamente proporcional al el número de núcleos resonantes (consulte, por ejemplo R. R. Emst, G. Bodenhausen y A. Wokaun, Priciples of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions, Oxford Science Publication, 1988, 91 - 157). Por lo tanto las integrales de los diferentes picos de señal en un espectro RMN reflejan el número de núcleos que contribuyen a cada pico de señal. A causa de lo anteriormente mencionado, la proporcionalidad entre las integrales de los picos de señal y el número de núcleos resonantes, la integral absoluta de un pico de señal RMN está directamente relacionada con el número de moléculas que contienen los núcleos resonantes que están presentes en el volumen de detección del espectrómetro RNM. Sin embargo, la integral absoluta de todos los picos de señal RMN en una muestra dada generalmente reaccionará de la misma forma en un anfitrión en condiciones experimentales. Sin embargo, el análisis cuantitativo por medio de espectroscopia RMN puede realizarse de una manera bastante sencilla si las señales integradas de una substancia de interés pueden compararse con las señales integradas de una substancia de referencia presente en una concentración conocida. Un problema en muchas aplicaciones analíticas de espectroscopia RMN viene provocado por el hecho de que una señal RMN de una substancia de interés puede superponerse con señales de otras substancias haciendo así difícil sino imposible la cuantificación. En particular, este problema se encuentra a menudo en muestras biológicas, en las cuales la probabilidad de una superposición no deseable de señales es bastante grande debido a un espectro RMN muy apiñado. Sin embargo, en muchas situaciones es posible desplazar la posición de una señal de interés de la región espectral apiñada hasta una región espectral básicamente vacía. Por ejemplo, la posición de una señal RMN de una substancia en una solución puede depender de diferentes factores, tales como el pH, la fuerza iónica, la composición salina y la concentración salina de la solución. Consecuentemente, puede conseguirse un desplazamiento deseable en la posición de la señal cambiando cualquiera de estos parámetros o añadiendo un agente conocido para desplazar la posición de la señal. Una dificultad del procedimiento de desplazamiento de las señales antes mencionado se debe al hecho de que en muchas situaciones no es posible identificar de manera no ambigua una señal desplazada, ya que la cantidad de desplazamiento de la señal puede depender de varios parámetros y así no se puede predecir de forma precisa. Además, un desplazamiento concurrente en la posición de la señal se inducirá a menudo en las señales de otras especies presentes en la muestra. Por lo tanto, el procedimiento de desplazamiento de señales conocido tiene la desventaja de que una señal desplazada de interés puede estar muy cerca de al menos otra señal de la que debe diferenciarse. La publicación WO 02/056048 A1 describe un procedimiento para identificar substancias diana en mezclas por medio de espectroscopia RMN y sugiere hacer uso de un espectro de referencia que tenga características que coincidan con las características de un espectro de ensayo producido a partir de la mezcla de muestras. También el documento WO 02/052293 A1 presenta la posibilidad de efectuar una comparación con espectros de 2   materiales auténticos y/o mediante la adición a la muestra de un estándar de referencia auténtico, por ejemplo para la asignación de espectros RMN 1H de biofluidos. El problema ya conocido de la superposición espectral es tratado en el artículo Use of 15N labeling for automated three-dimensional sorting of cross peaks in protein 2D NMR spectra, Weber P. L. y colaboradores, JMR, 1989, vol. 81, núm. 2, pág. 430 - 434. La superposición se reduce introduciendo una dimensión de desplazamiento químico adicional. De acuerdo con el artículo Qualitative análisis of carbon-13 NMR spectra by computer-assisted structure elucidation. II. Extensión to qualitative análisis of mixtures, Hashimoto M. S. y colaboradores, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, vol. 4, núm. 3, 1988, pág. 251 259, se evalúa una similitud de los desplazamiento químicos de los compuestos de referencia con los del espectro de la muestra por medio de un análisis de correlación. Resumen de la invención El principal objeto de la presente invención es vencer las limitaciones y desventajas de los procedimientos actualmente conocidos de RMN para la detección cualitativa y cuantitativa de substancias, particularmente en muestras biológicas. El anterior y otros objetos se consiguen mediante un procedimiento de la presente invención. De acuerdo con la reivindicación 1 se proporciona un procedimiento para detectar una substancia diana conocida en una muestra por medio de resonancia magnética nuclear (RMN) de especies preseleccionadas contenidas en la substancia diana. El procedimiento comprende los pasos de: a) suministrar una muestra de inicio que se conoce o se sospecha que contiene la substancia diana; b) añadir a la muestra de inicio una cantidad de substancia diana etiquetada con isótopos, obteniendo así una muestra compuesta, pudiéndose obtener la substancia diana etiquetada con isótopos a partir de la substancia diana sustituyendo al menos un núcleo de la misma por otro isótopo de la misma, en la que dicha sustitución induce un cambio en la posición o multiplicidad de al menos una señal RMN de la substancia diana; c) obtener señales RMN de las especies nucleares preseleccionadas a partir de la muestra compuesta; d) determinar las posiciones reales de un conjunto auxiliar de señales RMN de la substancia diana etiquetada con isótopos; e) calcular las posiciones reales de un conjunto principal de señales RMN de la substancia diana a partir de las posiciones reales del conjunto auxiliar de señales y a partir de una relación predeteIRMnada entre las posiciones relativas de las señales de la substancia diana etiquetada con isótopos y de las señales de la substancia diana; f) detectar al menos una señal de la substancia diana situada en una posición real calculada mediante el paso e). El término RMN o resonancia magnética nuclear tal como aquí se utiliza incluye, aunque no en sentido limitativo, RMN unidimensional (por ejemplo, RMN 1 H), RMN bidimensional (por ejemplo, HSQC o HMWC, NOESY, TOCSY, COSY), RMN tridimensional (por ejemplo, NOESY - TOCSY, HMQC - TOCSY) y la formación de imágenes mediante resonancia magnética (IRM). La técnica generalmente comprende el establecimiento de una condición de resonancia para una especie nuclear preseleccionada en un campo magnético. Tal como se conoce en la técnica la RMN requiere que la especie nuclear preseleccionada sea un isótopo con un momento angular de giro nuclear diferente de cero, tal como 1 H, 13 C y muchas otras. El término isótopos se usa generalmente para diferenciar núcleos que tienen el mismo número de protones pero un número diferente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar una substancia diana conocida en una muestra, por medio de resonancia magnética nuclear (RMN) de una especie nuclear preseleccionada contenida en la substancia diana, el procedimiento comprende los pasos de: a) suministrar una muestra de inicio que se sabe o se sospecha que contiene la substancia diana; b) añadir a la muestra de inicio una cantidad de substancia diana etiquetada con isótopos, obteniendo así una muestra compuesta, obteniéndose la substancia diana etiquetada con isótopos a partir de la substancia diana mediante la sustitución de al menos uno de sus núcleos por otro de sus isótopos, donde dicha sustitución induce un cambio en la posición o la multiplicidad de al menos una señal RMN de la substancia diana; c) adquirir señales RMN de la especie nuclear preseleccionada a partir de la muestra compuesta; d) determinar las posiciones reales de un conjunto auxiliar de señales RMN de la substancia diana etiquetada con isótopos; e) calcular las posiciones reales de un conjunto principal de señales RMN de la substancia diana a partir de las posiciones reales del conjunto auxiliar de señales y a partir de una relación predeterminada entre las posiciones relativas de las señales de la substancia diana etiquetada con isótopos y de las señales de la substancia diana; f) detectar al menos una señal de la substancia diana situada en una posición real calculada mediante el paso e). 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en dicha sustitución del paso b) al menos uno de dicho núcleo o de dicho isótopo que sustituye dicho núcleo tiene un espín nuclear diferente de 0. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el paso b) comprende la mezcla de la substancia diana etiquetada con isótopos con la muestra de inicio. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además el paso de: a1) adquirir señales RMN de la muestra de inicio para la especie nuclear preseleccionada que se lleva a cabo entre los pasos a) y b), en donde el paso d) se lleva a cabo sustrayendo las señales RMN adquiridas en el paso a1) de las señales RMN adquiridas en el paso c). 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el paso d) se lleva a cabo mediante una técnica de edición de isótopos que suprime selectivamente las señales RMN de la substancia diana. 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además el paso de cuantificar la substancia diana en relación con la cantidad de substancia diana añadida etiquetada con isótopos basándose en las intensidades relativas de las señales del conjunto principal y auxiliar de señales RMN. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el conjunto auxiliar de señales RMN comprende al menos dos señales de la substancia diana etiquetada con isótopos y en el que el conjunto principal de señales RMN comprende una señal simple de la substancia diana. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la especie nuclear preseleccionada es 1 H o 13 C. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra de inicio es una muestra biológica. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el otro isótopo de la substancia diana etiquetada con isótopos se selecciona entre 13 C, 2 H y 15 N. 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la RMN es RMN unidimensional. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la RMN es RMN bidimensional. 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la RMN es la formación de imágenes mediante resonancia magnética nuclear.   11   12   13   14