DERIVADOS DE GLUCOSAMINOGLUCANOS PARCIALMENTE DESULFATADOS COMO INHIBIDORES DE HEPARANASA, PROVISTOS DE ACTIVIDAD ANTIANGIOGÉNICA Y DESPROVISTOS DE EFECTO ANTICOAGULANTE.

Derivados de glucosaminoglucanos parcialmente desulfatados como inhibidores de heparanasa, provistos de actividad antiangiogénica y desprovistos de efecto anticoagulante La invención descrita en el presente documento se refiere a heparinas parcialmente desulfatadas, a procedimientos para su preparación, a su uso como ingredientes activos para la preparación de medicamentos útiles en afecciones patológicas, como tumores, incluidas las formas metastásicas, y para cualquier indicación terapéutica que obtenga beneficios de la inhibición de la heparanasa, y a composiciones farmacéuticas que las contienen. Estado de la técnica Estudios realizados en la Unidad de Investigación Biológica de Tumores de la Hadassah-Hebrew University Hospital-Israel (Isr. Med. Assoc. J. 2000, 2, 37-45; J. Med. Chem. 2000, 43, 2591-600; Invasion Metastasis 1994-95, 14, 290-302; Exp. Cell Res. 1992, 201, 208-15;) se centran en la implicación de los factores de crecimiento de unión a heparina, heparán sulfato y enzimas de degradación de heparán sulfato (heparanasa) en la angiogénesis y la metástasis tumoral. Estos estudios se han aplicado a la detección selectiva y a la identificación de derivados de heparina y miméticos de heparina/heparán sulfato con una potente actividad de inhibición de heparanasa (Nature Med. 1999, 5, 735-6; Science, 1999, 285, 33-4]. Las células tumorales liberan la enzima heparanasa, una endo-ß-D-glucuronidasa que degrada la cadena polisacárida de los proteoglicanos de heparán sulfato sobre las superficies celulares y en la matriz extracelular. La implicación de la heparanasa en la angiogénesis tumoral se ha correlacionado con la capacidad para liberar bFGF (FGF-2) y otros factores de crecimiento desde su almacenamiento dentro de la MEC (matriz extracelular). Estos factores de crecimiento proporcionan un mecanismo para la inducción de neovascularización en situaciones normales y patológicas. Por tanto, la heparanasa puede facilitar no sólo la invasión de células tumorales y la metástasis sino también la angiogénesis tumoral, ambas etapas críticas en la progresión del tumor. Inhibidores específicos de la enzima heparanasa impiden la liberación y la activación de los factores de crecimiento almacenados por heparán sulfato, así como la rotura de la MEC y se considera un abordaje muy prometedor para el desarrollo de fármacos anticancerosos. Por tanto, uno de los posibles abordajes terapéuticos para un fármaco antiangiogénico es el desarrollo de un potente y selectivo inhibidor de heparanasa. Para comentarios sobre la angiogénesis, se puede hacer referencia al documento WO 01/55221, en nombre del presente solicitante. Otra implicación importante de la heparanasa es la inflamación y la autoinmunidad. De hecho, la actividad heparanasa se correlaciona también con la capacidad de células activadas del sistema inmunitario para salir de la circulación y producir respuestas inflamatorias y autoinmunitarias. La interacción de plaquetas, granulocitos, linfocitos T y B, macrófagos y mastocitos con la MEC subendotelial se asocia con la degradación de heparán sulfato mediante actividad de heparanasa. La enzima se libera desde los compartimentos intracelulares (es decir, lisosomas, gránulos específicos) en respuesta a varias señales de activación, lo que sugiere su implicación regulada y la presencia en sitios inflamatorios y lesiones autoinmunitarias. El tratamiento de animales experimentales con inhibidores de la heparanasa (es decir, especies no anticoagulantes de heparina de bajo peso molecular- HBPM) redujo marcadamente la incidencia de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), artritis adyuvante y rechazo del injerto en animales experimentales, lo que indica que los inhibidores de heparanasa se pueden aplicar para inhibir la enfermedad autoinmunitaria e inflamatoria. Heparina ES 2 367 778 T3 La heparina es una mezcla heterogénea de polisacáridos naturales de varias longitudes y varios grados de sulfatación que posee actividad anticoagulante y es secretada por los mastocitos del tejido conjuntivo presentes en el hígado (del que se aisló por primera vez), en los músculos, pulmones, timo y bazo. Además de la secuencia regular, se ha identificado en la heparina una secuencia correspondiente al sitio activo de la actividad antitrombina. La actividad antitumoral y antimetastásica de la heparina y sus derivados se debe a su capacidad para inhibir la heparanasa, para bloquear los factores de crecimiento y para regular la angiogénesis. 2 Heparán sulfatos (HS) Los heparán sulfatos (HS) son ligandos proteicos ubicuos. Las proteínas se unen a las cadenas de HS para diversas acciones, desde la simple inmovilización o protección frente a la acción de degradación proteolítica hasta modulaciones específicas de actividades biológicas, tales como angiogénesis. El esqueleto de hidrato de carbono, tanto en la heparina como en los heparán sulfatos (HS), consta de una alteración de D-glucosamina (GlcN) y ácidos hexurónicos (GlcA o IdoA). En la heparina, los residuos GlcN son, principalmente, N-sulfatados, mientras que en los HS son N-sulfatados y Nacetilados, con una cantidad pequeña de grupos NH2 insustituidos. El HS también está, de medio, menos O-sulfatado que la heparina. El uso de heparina en el tratamiento de los trastornos de angiogénesis, tales como tumores, particularmente metástasis, está sustancialmente limitado por la actividad anticoagulante de la heparina. Se han efectuado modificaciones químicas en la heparina para reducir su capacidad anticoagulante, conservando al mismo tiempo sus propiedades antitumorales. La abertura de una unidad de ácido glucurónico en el sitio de la antitrombina reduce la afinidad de la heparina por la antitrombina, De este modo, las heparinas se pueden usar con menos efectos anticoagulantes, pero todavía conservan propiedades antiangiogénicas. Heparanasas Las heparanasas son enzimas que pertenecen a una familia de endoglicosidasas (una endo-ß-D-glucuronidasa) que hidroliza los enlaces glucosídicos internos de las cadenas de heparán sulfatos (HS) y heparona. Estas endoglicosidasas están implicadas en la proliferación de las células tumorales, en la metástasis y en la neovascularización de los tumores. Estas enzimas son dianas biológicas de la actividad antiangiogénica. En la literatura científica hay un gran número de estudios de correlación estructura/actividad (véase, por ejemplo, Lapierre F. y col., Glycobiology, vol. 6, (3), 355-366, 1996). Aunque todavía quedan por aclarar muchos aspectos, se han comunicado estudios sobre la inhibición de las heparanasas por la heparina y sus derivados; usando pruebas específicas que han conducido a la aparición de consideraciones de un tipo estructural pueden servir como guías para la obtención de nuevos derivados más selectivos. En el trabajo mencionado anteriormente de Lapierre y col., los derivados de heparina se describen tal como se obtienen mediante 2-O-desulfatación o mediante "división de glicol" (oxidación con peryodato y la posterior reducción con borohidruro sódico. Estos derivados, definidos en el presente documento como heparina 2-Odesulfatada y RO-heparina, respectivamente, han mantenido parcialmente la actividad antiangiogénica de la heparina, evaluado por medio de la prueba CAM en presencia de corticosteroides (ídem, página 360). Se ha comunicado que los derivados de N-acil-heparina, que son imitadores más cercanos del heparán sulfato que la heparina, inhiben la heparanasa únicamente algo menos que los derivados N-sulfato. (Irimira T., Biochemistry 1986, 25, 5322-5328; Ishai- Michaeli R., y col, Biochemistry 1992, 31, 2080-2088). Heparinas y FGF Los FGF regulan múltiples procesos fisiológicos, tales como el crecimiento y la diferenciación celular, y también funciones implicadas en procesos patológicos, tales como la angiogénesis tumoral. Los FGF son factores de crecimiento (una familia de más de 10 polipéptidos, de los cuales los FGF ácido (FGF-1) y básico (FGF-2) son los que se han estudiado más, que requieren un factor polisacárido, heparina o HS, para unirse al receptor de FGF (FGFR) y activarlo. Aunque el mecanismo preciso por el que la heparina y el HS activan los FGF se desconoce, se sabe, no obstante, que la heparina/FGF/FGFR forman un complejo trimolecular o ternario. Un mecanismo postulado es que la heparina y el HS inducen la denominada dimerización en sándwich del FGF y, este último, aunque dimerizado, forma un complejo estable con el FGFR. Actividad antimetastásica de los derivados de heparina ES 2 367 778 T3 La capacidad de un tumor primario para generar células metastásicas es, quizá, el principal problema con el que se enfrenta la terapia anticancerosa. Los derivados de heparina con una actividad considerable para bloquear la heparanasa parecen ser igualmente 3 ES 2 367 778 T3 capaces de inhibir... 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1.- Heparina modificada que contiene residuos de glucosamina con diferentes grados de N-desulfatación, en el que dicha N-acetilación posterior obtenible sometiendo la heparina al procedimiento que consiste en las etapas siguientes: a) N-desulfatación mediante hidrólisis solvolítica de los residuos de sulfamino en DMSO:H2O 95:5 v:v a temperatura ambiente durante un tiempo que varía de 0,5 a 8 horas, para dar la eliminación total o parcial de los grupos sulfato en la posición 2 de los residuos de glucosamina; b) N-acetilación de dichos grupos total o parcialmente desulfatados en la posición 2 de los residuos de glucosamina mediante tratamiento en solución acuosa alcalina (pH 8-9) con un agente acetilante, para dar grupos total o parcialmente acetilado en la posición 2 de los residuos de glucosamina; c) oxidación de los dioles con peryodato sódico, para dar la abertura del anillo glicósido y la formación de dos grupos aldehídos por residuo modificado; d) reducción de dichos grupos aldehídos en el alcohol primario; e) hidrólisis ácida opcional de compuestos obtenidos en la etapa d) para obtener oligosacáridos correspondientes a las secuencias regulares, o, como alternativa, f) someter los productos obtenidos en la etapa d) a hidrólisis enzimática parcial con una enzima seleccionada del grupo que consiste en liasa, heparinasa, heparitinasa o equivalente, para dar oligosacáridos, preferentemente tetra u octasacáridos, consistiendo el residuo terminal no reductor en ácido idurónico no saturado, consistiendo el residuo terminal reductor en una N-sulfoglucosamina y que contiene al menos un residuo de ácido idurónico abierto. 2.- La heparina de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en: - heparina parcialmente N-desulfatada y N-reacetilada con un peso molecular (PM) de 11.200, un índice de polidispersión de 1,3, un grado de desulfatación de 1,6 (expresado como una proporción molar SO3:COO-), un porcentaje de ácidos urónicos modificados comparados con los ácidos urónicos totales de aproximadamente 30% y los residuos de glucosamina tienen un grado de N-acetilación del 50 %. - heparina de bajo peso molecular parcialmente N-desulfatada y N-reacetilada con un peso molecular de Mn= 4780, Pm= 10.000, un índice de polidispersión de 2,092, un porcentaje de ácidos urónicos modificados comparados con los ácidos urónicos totales de aproximadamente 30 % y los residuos de glucosamina tienen un grado de Nacetilación del 50%. - heparina parcialmente N-desulfatada y N-reacetilada, un porcentaje de ácidos urónicos modificados en comparación con ácidos urónicos totales de aproximadamente 30% y los residuos de glucosamina tienen un grado de N-acetilación del 27%. - heparina parcialmente N-desulfatada y N-reacetilada, un porcentaje de ácidos urónicos modificados en comparación con ácidos urónicos totales de aproximadamente 30% y los residuos de glucosamina tienen un grado de N-acetilación del 39%. - heparina parcialmente N-desulfatada y N-reacetilada, un porcentaje de ácidos urónicos modificados en comparación con ácidos urónicos totales de aproximadamente 30% y los residuos de glucosamina tienen un grado de N-acetilación del 64%. 3.- Uso de los compuestos de la reivindicación 1 o 2 para la preparación de un medicamento que tiene actividad de inhibición de la heparanasa. 4.- Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho medicamento tiene actividad antiangiogénica. 5.- Uso de acuerdo con las reivindicaciones 3-4, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de inflamaciones. 6.- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. 7.- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que la enfermedad que se va a tratar se selecciona del grupo que consiste en tumores primarios, metástasis, retinopatías diabéticas, psoriasis, fibroplasia retrolenticular, reestenosis tras angioplastia, derivación coronaria, inflamación, artritis, enfermedades autoinmunitarias, rechazo del aloinjerto, enfermedades cardiovasculares, enfermedades fibroproliferativas, enfermedades provocadas por agregación plaquetaria anómala, enfermedades provocadas por proliferación del 11 ES 2 367 778 T3 músculo liso, síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis aguda, hipertensión pulmonar neonatal, asma, insuficiencia cardíaca congestiva, hipertensión pulmonar adulta, hipertensión vascular renal, retinopatías proliferativas, encefalopatía autoinmunitaria experimental, esclerosis múltiple, diabetes dependiente de insulina, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn. 8.- Composición farmacéutica que contiene al menos un compuesto de la reivindicación 1 o 2 como un ingrediente activo en mezcla con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. 12 ES 2 367 778 T3 13