CONJUGADOS DE ALMIDÓN HIDROXIALQUILICO Y DE G-CSF.

Un procedimiento para preparar un conjugado que comprende una proteína y un derivado polimérico,

en el que el polímero es un almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar al menos un grupo A funcional del derivado polimérico con al menos un grupo Z funcional de la proteína y formar de dicha forma un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino, y en el que A se selecciona entre el grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, en el que el procedimiento comprende además introducir A en el polímero para dar un derivado polimérico haciendo reaccionar el polímero con un al menos compuesto bifuncional, un grupo funcional que se hace reaccionar con el polímero y al menos otro grupo funcional que es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo funcional que está químicamente modificado de manera adicional para dar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y en el que la reacción del derivado polimérico con la proteína es una aminación reductora

Conjugados de almidón hidroxialquílico y de G-CSF.

La presente invención se refiere a conjugados de almidón hidroxialquílico y a una proteína del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) en la que estos conjugados se forman mediante un enlace covalente entre el almidón hidroxialquílico o un derivado del almidón hidroxialquílico y la proteína. La presente invención se refiere también al procedimiento para producir estos conjugados y al uso de estos conjugados.

Se acepta generalmente que se puede mejorar la estabilidad de las proteínas y reducirse la respuesta inmune frente a estas proteínas cuando estas proteínas se acoplan a moléculas poliméricas. El documento WO 94/28024 da a conocer que las proteínas fisiológicamente activas modificadas con el polietilenglicol (PEG) presentan inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más tiempo que las proteínas no conjugadas, es decir, tienen una reducida velocidad de aclaramiento.

G-CSF es una glucoproteína de 21 kDa estabilizada mediante dos enlaces disulfuro intracadena que contienen un único resto carbohidrato unido a O. G-CSF madura tiene 174 aminoácidos. En el cuerpo animal, G-CSF se sintetiza en las células estromales, en macrófagos y en fibroblastos de la médula ósea. Su función principal es la de ser un factor de crecimiento y de diferenciación de los neutrófilos y de sus células precursoras. Sin embargo, se conoce en la materia que G-CSF activa los neutrófilos maduros. Además, estimula el crecimiento/diferenciación de otras diversas células progenitoras hematopoyéticas (en sinergia con factores de crecimiento hematopoyéticos adicionales) y promueve la proliferación y la migración de las células endoteliales. Clínicamente, G-CSF se administra para el tratamiento de las deficiencias en los niveles de neutrófilos (producidas, por ejemplo, por la anemia aplásica, la mielodisplasia, el SIDA, o la quimioterapia).

El documento WO 02/09766 da a conocer, entre otros, compuestos de proteína-polímero biocompatibles que se producen mediante conjugación de proteínas biológicamente activas con un derivado de polímero biocompatible. Los polímeros biocompatibles usados son polímeros ramificados muy reactivos, y los conjugados resultantes contienen un enlazante largo entre el derivado de polímero y la proteína. Como polímeros biocompatibles, se describen los polímeros de fórmula (P-OCH₂CO-NH-CHR-CO-)_n-L-Q_k-A, en la que P y Q son restos poliméricos y k puede ser 1 ó 0. Para P y Q, se mencionan polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxietileno, politrimetilenglicol, ácido poliláctico y sus derivados, ácido poliacrílico y sus derivados, poliaminoácido, alcohol polivinílico, poliuretano, polifosfaceno, poli(L-lisina) óxido de polialquileno, poliacrilamida, y polímeros solubles en agua tales como dextrano o polisacáridos. Como proteínas, se mencionan entre otras, interferones alfa, beta y gamma, factores de la sangre, citocinas tales como interleucinas, G-CSF, GM-CSF. En los ejemplos del documento WO 02/09766 se dan a conocer únicamente derivados de mono, di y tripolietilenglicol, que se acoplan exclusivamente al interferón y al factor de crecimiento epidérmico, y a la hormona del crecimiento humana.

El documento WO 94/01483 da a conocer conjugados de polímeros biocompatibles que se forman mediante enlace covalente de un polímero o derivado de polímero biológicamente inactivo con un polímero hidrófilo sintético farmacéuticamente puro mediante tipos específicos de enlaces químicos. Como polímeros que se producen naturalmente y sus derivados, se dan a conocer polisacáridos tales como ácido hialurónico, proteoglicanos tales como sulfatos A, B y C de condroitina, heparina, sulfato de heparina, dextranos tales como ciclodextrano, hidroxietil celulosa, éter de celulosa y almidón, lípidos tales como triglicéridos y fosfolípidos. Como polímeros sintéticos, entre otros, se describen polietilenos y sus derivados que tienen un peso molecular promedio de entre aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000. Como proteínas unidas al polímero o derivado de polímero, se describen citocinas y factores de crecimiento, entre los que se incluyen interferones, y se dan a conocer factores de necrosis tumoral, interleucinas, factores estimuladores de colonias, factores de crecimiento tales como extracto de factor osteogénico, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor ácido de crecimiento de fibroblastos y otros. En todos los ejemplos de trabajo del documento WO 94/01483, se usan como polímeros derivados de polietilenglicol.

El documento WO 96/11953 da a conocer compuestos de proteínas modificadas químicamente en el extremo N y los procedimientos para su producción. Específicamente, se describen composiciones de G-CSF que son el resultado de acoplar un polímero soluble en agua en el extremo N de G-CSF. En el contexto del documento WO 96/11953, se dan a conocer interferones consenso acoplados en el extremo N a polímeros solubles en agua. Aunque se relaciona una amplia variedad de polímeros hídricos en el documento WO 96/11953 (por ejemplo, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatorios), poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno o polioles polioxietilados), se describen solo composiciones de G-CSF PEGilado o composiciones de IFN consenso en los ejemplos del documento WO 96/11953.

El documento US 6.555.660 B2 da a conocer conjugados de polipéptidos que comprenden un polipéptido que presenta actividad G-CSF y que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de G-CSF humana en al menos un resto de aminoácido especificado y/o eliminado, en el que el conjugado comprende un grupo de unión de un resto no polipeptídico, y comprende además al menos un resto no polipeptídico unido al grupo de unión del polipéptido. El resto no polipeptídico puede ser un polímero tal como polietilenglicol o un oligosacárido. En el documento US 6.555.660 B2 se define explícitamente y sin ambigüedad que PEG es de lejos la molécula de polímero más preferida debido a que tiene unos pocos grupos reactivos capaces de reticularse en comparación con polisacáridos tales como dextrano.

El documento WO 97/30148 se refiere a conjugados de polipéptidos con alergenicidad reducida que comprenden una molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas de polipéptidos acopladas a la anterior. Estos conjugados son preferiblemente parte de las composiciones usadas en el mercado del cuidado personal. Dichos conjugados se producen activando una molécula portadora polimérica, haciendo reaccionar dos o más moléculas de polipéptidos con la molécula portadora polimérica activada y bloqueando los grupos residuales activos del conjugado. Como molécula portadora polimérica, se relaciona una gran variedad en el documento WO 97/30148, que incluye los mencionados grupos diferentes de compuestos homopoliméricos de tipo natural o sintético tales como polioles, poliaminas, ácidos policarboxílicos, y heteropolímeros que comprenden al menos dos grupos de unión diferentes. Se proporcionan ejemplos, que comprenden PEG de tipo estrella, PEG ramificados, alcoholes polivinílicos, policarboxilatos, polivinilpirrolidonas y poli-D,L-aminoácidos Entre otros, se dan a conocer también dextranos tales como carboximetil dextrano, celulosas tales como hidroxietilcelulosa o hidroxipropilcelulosa, hidrolizados de quitosán, almidones tales como hidroxietil almidones o hidroxipropil almidones, glucógeno, agarosa, goma guar, inulina, pululano, goma xantana, carragenatos, pectina, ácido algínico. Como polipéptidos, se dan a conocer únicamente de manera explícita algunas enzimas.

Baldwin, J.E. y col., Tetrahedron, vol. 27 (1981), pp. 1723-1726 describen la modificación química del dextrano y del hidroxietil almidón para dar polímeros sustituidos con aldehído que se dejan reaccionar con hemoglobina para dar hemoglobinas unidas a polímeros. Se muestra que estas son capaces de unirse a oxígeno, pero los experimentos de perfusión cardiaca indicaron claramente que las hemoglobinas unidas a polímeros no fueron adecuadas para el uso como sustitutos de la sangre.

1. Un procedimiento para preparar un conjugado que comprende una proteína y un derivado polimérico, en el que el polímero es un almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar al menos un grupo A funcional del derivado polimérico con al menos un grupo Z funcional de la proteína y formar de dicha forma un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino, y en el que A se selecciona entre el grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, en el que el procedimiento comprende además introducir A en el polímero para dar un derivado polimérico haciendo reaccionar el polímero con un al menos compuesto bifuncional, un grupo funcional que se hace reaccionar con el polímero y al menos otro grupo funcional que es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo funcional que está químicamente modificado de manera adicional para dar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y en el que la reacción del derivado polimérico con la proteína es una aminación reductora.

2. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 1 en el que el almidón hidroxialquílico es almidón hidroxietílico.

3. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 2 en el que el almidón hidroxietílico tiene un peso molecular de entre 2 a 200 kD, preferiblemente de entre 4 a 130 kD, más preferiblemente de entre 4 a 70 kD.

4. El procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar adicionalmente el polímero con un grupo M funcional de un al menos compuesto bifuncional para dar un derivado polimérico, el al menos compuesto bifuncional que comprende además al menos otro grupo Q funcional que es el grupo aldehído, el grupo ceto o el grupo A hemiacetal.

5. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 4, en el que M comprende un grupo amino.

6. El procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar adicionalmente el polímero con un grupo M funcional de un al menos compuesto bifuncional para dar un derivado polimérico, el al menos compuesto bifuncional comprende además al menos otro grupo Q funcional que no es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar adicionalmente el grupo Q funcional con al menos un compuesto adecuado para dar el derivado polimérico que comprende el grupo aldehído, el grupo ceto o el grupo A hemiacetal.

7. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 5, en que M y Q comprenden un grupo amino.

8. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 6 o 7, en el que al menos un compuesto adecuado comprende un grupo carboxilo y un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal.

9. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 8, en el que al menos un compuesto adecuado es ácido formilbenzoico o ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.

10. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 6 o 7, en el que M comprende un grupo amino y Q comprende un grupo beta hidroxi amino.

11. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 10, en el que se hace reaccionar el polímero en su extremo reductor oxidado con un grupo M funcional de un al menos compuesto bifuncional.

12. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 10, que comprende oxidar adicionalmente el grupo beta hidroxiamino para dar el grupo aldehído.

13. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 12, en el que se lleva a cabo la reacción de oxidación usando un periodato.

14. El procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que se lleva a cabo la aminación reductora en presencia de NaCNBH₃.

15. El procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se lleva a cabo la aminación reductora a un pH de 7 o inferior.

16. El procedimiento que se reivindica en la reivindicación 15, en el que el pH es 6 o inferior.

17. El procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que se lleva a cabo la aminación reductora a una temperatura de entre 0 a 25ºC.

18. El procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se lleva a cabo la aminación reductora en un medio acuoso.

19. Un conjugado que es obtenible mediante un procedimiento que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

20. Un conjugado que comprende una proteína y un polímero o derivado del mismo, en el que el polímero es un almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula

en las que R₁, R₂ y R₃ son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de entre 2 a 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

en las que L es un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, que tiene entre 1 a 60, preferiblemente entre 1 a 40, más preferiblemente entre 1 a 20, más preferiblemente entre 1 a 10, más preferiblemente entre 1 a 6, más preferiblemente entre 1 a 2 átomos de carbono, y de manera especialmente preferible 1 átomo de carbono, siendo L en particular CH₂.

21. Un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, en el que el polímero es un almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula

en la que R₁, R₂ y R₃ son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de entre 2 a 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y

en la que L₁ y L₂ son independientemente un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquil heteroalquilo, y/o heteroaralquilo, teniendo dicho resto entre 1 a 60, preferiblemente entre 1 a 40, más preferiblemente entre 1 a 20, más preferiblemente entre 1 a 10 átomos de carbono, y

en la que D es un enlace, preferiblemente un enlace covalente que se formó mediante un grupo F₂ funcional adecuado unido a L₁ y un grupo F₃ funcional adecuado unido a L₂.

22. El conjugado que se reivindica en la reivindicación 21, en el que L₁ es -(CH₂)n- con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4, y de manera especialmente preferible 4.

23. El conjugado que se reivindica en la reivindicación 21 o 22 en el que L₂ comprende un resto arilo sustituido opcionalmente de manera adecuada, preferiblemente un resto arilo que contiene 6 átomos de carbono, siendo L₂ de manera especialmente preferible C₆H₄.

24. El conjugado que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que F₂ se selecciona entre el grupo que consiste en

- dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;

- el grupo tio o los grupos hidroxilo;

- hidrazida del ácido alquil sulfónico, hidrazida del ácido aril sulfónico;

- 1,2-dioles;

- 1,2-aminoalcoholes;

- 1,2 amino-tioalcoholes;

- azidas;

- el grupo amino -NH₂ o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad de estructura -NH- tales como grupos aminoalquílicos, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;

- el grupo hidroxilamino -O-NH₂-, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad de estructura -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxilalcarilamino;

- grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad de estructura NH-O-;

- restos que tienen un grupo carbonilo, Q-C(=G)-M en el que G es O u S, y M es, por ejemplo,

-- -OH o -SH;

-- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo, o un grupo alcariloxilo;

-- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio;

-- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo;

-- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad de estructura O-N en la que N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tales como compuestos de ariloxilo con un resto arilo sustituido tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;

en el que Q está ausente o es NH o un heteroátomo tal como S u O;

- -NH-NH₂, o -NH-NH-;

- -NO₂;

- el grupo nitrilo

- grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;

- el grupo carboxilo;

- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;

- grupos de haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinilo o triflato;

- -C=C-H;

- -(C=NH₂Cl)-OAlquilo

- Grupos -(C=O)-CH₂-Hal en el que Hal es Cl, Br, o I;

- -CH=CH-SO₂-;

- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;

- el grupo

- el grupo

y en la que F₃ es un grupo funcional capaz de formar un enlace químico con F₂ y se selecciona preferiblemente entre el grupo anteriormente mencionado, comprendiendo F₂ preferiblemente el resto -NH-, que comprende más preferiblemente un grupo amino, comprendiendo F₃ preferiblemente el resto -(C=G)-, más preferiblemente -(C=O)-, más preferiblemente el resto -(C=G)-G-, aún más preferiblemente -(C=O)-G-, y de manera especialmente preferible -(C=O)-O, siendo D de manera particularmente preferible un enlace amida.

25. El conjugado que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que el almidón hidroxialquílico es almidón hidroxietílico.

26. El conjugado que se reivindica en la reivindicación 25 en el que el almidón hidroxietílico tiene un peso molecular de entre 2 a 200 kD, preferiblemente de entre 4 a 130 kD, más preferiblemente de entre 4 a 70 kD.

27. Un conjugado que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, para uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

28. Una composición farmacéutica que comprende en una cantidad terapéuticamente eficaz un conjugado que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26.

29. Una composición farmacéutica que se reivindica en la reivindicación 28, que comprende además al menos un diluyente, potenciador o vehículo farmacéuticamente aceptable.

30. Un conjugado que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26 para uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno caracterizado por una función hematopoyética o inmune reducida.

31. El conjugado que se reivindica en la reivindicación 30, en el que el trastorno es un resultado de quimioterapia, terapia de radiación, enfermedad infecciosa, neutropenia crónica grave, o leucemia.