CONJUGADO DE CIANINA-CLOROTOXINA Y PROCEDIMIENTO PARA LA VISUALIZACIÓN INTRAQUIRÚRGICA DEL CÁNCER.

Un conjugado de clorotoxina constituido por uno o más restos Cy5.5 acoplados covalentemente a una clorotoxina

En muchos tipos de cánceres, la precisión de la resección quirúrgica afecta directamente el pronóstico del paciente. Desafortunadamente, la identificación intraquirúrgica de los bordes del tumor o de pequeños foci de células cancerosas resulta imprecisa o depende del juicio quirúrgico. De esta manera, la extensión de la resección quirúrgica está limitada por la necesidad de evitar el daño a estructuras vitales. No hay ninguna parte en la que sea más problemática que en el cerebro, en el que la más del 80% de los cánceres malignos se produce en el margen quirúrgico. A pesar de los avances en la monitorización intraquirúrgica y en el guiado por imágenes, los escáneres postquirúrgicos desvelan algunas veces tumores residuales voluminosos que se hubieran podido eliminar mediante resección si el cirujano hubiera dispuesto de herramientas mejoradas para distinguir el tejido tumoral del cerebro normal. Recientes avances en biología molecular, genómica y proteonómica han dado como resultado información acerca de las moléculas que se expresan en células malignas pero no en tejidos adyacentes. Esta información tiene el potencial de transformar fundamentalmente la oncología quirúrgica si se usa para “pintar” específicamente las células tumorales con balizas moleculares dirigidas

La metaloproteinasa de matriz (MMP-2) tiene una expresión muy elevada en muchas neoplasias humanas comunes que incluyen glioma, melanoma, sarcoma, cáncer de mama, adenocarcinoma de colon, cáncer de próstata, tumores neuroectodérmicos, y cáncer de ovario. Se cree que MMP-2 y otros miembros de la familia MMP contribuyen a la invasión cancerosa degradando proteolíticamente el tejido no neoplásico adyacente.

Aislada del escorpión Leirus quinquestriatus, la clorotoxina (CTX) es un péptido de 36 aminoácidos que se caracterizó inicialmente como un ligando que bloqueaba los canales de cloruro reconstituidos. Se pensaba que CTX inhibía la migración de células del glioma bloqueando los canales de cloruro específicos de glioma, pero esta actividad se atribuyó posteriormente a la inhibición de MMP-2 mediada por CTX. La clorotoxina se une preferentemente a las células de glioma en comparación con el cerebro normal. Se ha aprobado recientemente un enlace radiofarmacéutico a una clorotoxina sintética, 131I.TM-601, para los ensayos clínicos en Fase I/II para la terapia del cáncer cerebral basándose en un perfil de seguridad aceptable en los estudios preclínicos.

Los compuestos de cianina son balizas moleculares que emiten luz en el espectro del infrarrojo cercano (NIR). Puesto que la luz de esta longitud de onda se adsorbe mínimamente por el agua o la hemoglobina, las balizas NIR son muy adecuadas para la obtención de imágenes intraquirúrgicas. Intentos anteriores de obtención de imágenes de tumores cerebrales mediante NIR se han centrado en el direccionamiento de la sonda hacia la microglía inflamatoria que rodea el tumor o en utilizar sondas que requieren de escisión proteolítica para la activación. El anterior enfoque es problemático debido a la presencia de microglía que se correlaciona poco, si acaso algo, con los márgenes de muchos tumores cerebrales. Además, para reducir el edema cerebral postquirúrgico, los pacientes se tratan con dexametasona, que es un potente inhibidor de la activación microglial.

El documento US 5.905.027 describe un procedimiento de diagnóstico y tratamiento de gliomas.

Soroceanu L. y col., Cancer Research, Vol. 58 (21) 1 de noviembre de 1998, páginas 4871-4879, describen el uso de clorotoxina para dirigirse a tumores cerebrales primarios.

Weissleder R. y col., Nature Medicine, Vol. 9(1) 1 de enero de 2003, páginas 123-128, describen estudios aplicando luz a dianas moleculares vivas.

Citrin D. y col., Molecular Cancer Therapeutics, Vol. 3(4), 2004, páginas 481-488, describen la obtención de imágenes de un tumor in vivo en ratones con endostatina marcada en el infrarrojo cercano.

Berlier J.E. y col., J. Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 51 diciembre de 2003, páginas 1699-1712, describen una comparación cuantitativa de colorantes Alexa Fluor de longitud de onda larga con colorantes Cy y sus bioconjugados.

El documento WO 00/62807 describe el diagnóstico y el tratamiento de tumores neuroectodérmicos

Deshane J. y col., J. Biol. Chem. Vol. 278(6), 7 de febrero de 2003, páginas 4135-4144, informan que la clorotoxina inhibe la invasión de células de glioma mediante la metaloproteinasa-2 de matriz

Jiang T. y col., PNAS USA Vol 101 (51), 21 de diciembre de 2004, páginas 17867-17872, describen la obtención de imágenes de tumores por medio de la activación proteolítica de péptidos que penetran en células.

A pesar de los avances en el desarrollo de sondas para dirigir y obtener imágenes de tumores cerebrales, y a la vista de los factores señalados anteriormente, existe una necesidad de una sonda que no necesite escisión enzimática y que permita la visualización intraquirúrgica de los tejidos cancerosos. La presente invención busca llenar esta necesidad y proporciona otras ventajas relacionadas.

En un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado de clorotoxina (tal como se define en las reivindicaciones, que se puede detectar mediante obtención de una imagen de fluorescencia, que permite la visualización intraquirúrgica de los tejidos cancerosos.

El conjugado de clorotoxina de la invención se usa en la obtención de una imagen in vivo, e incluye uno o más restos Cy5.5 acoplados covalentemente a una clorotoxina.

En otra realización, el conjugado de clorotoxina fluorescente tiene una prolongada semivida in vitro. El conjugado de clorotoxina fluorescente incluye uno o más restos Cy5.5 acoplados covalentemente a una clorotoxina En una realización, el conjugado tiene una semivida suficientemente larga para permitir la formación de una por imagen biofotónica del cáncer desde aproximadamente 4 a aproximadamente 14 días después de la administración del conjugado de clorotoxina.

Se proporcionan composiciones que incluyen el conjugado de clorotoxina. La composición es adecuada para su administración a un ser humano e incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición incluye una cantidad farmacéuticamente eficaz de un conjugado de clorotoxina.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos in vitro para usar el conjugado de clorotoxina para detectar tejidos de interés, según se define en las reivindicaciones.

En una realización, se proporciona un procedimiento in vitro para diferenciar foci de cánceres que expresan sitios de unión a clorotoxina a partir de tejido no neoplásico. El procedimiento incluye las etapas de:

(a) poner en contacto un tejido de interés con un conjugado de clorotoxina según se define en las reivindicaciones, que tiene afinidad y especificidad por células que expresan sitios de unión a clorotoxina; y

(b) medir el nivel de unión del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel elevado de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplásico.

En una realización, se proporciona un procedimiento in vitro para detectar cánceres que expresan sitios de unión a clorotoxina. El procedimiento incluye las etapas de:

(a) poner en contacto un tejido de interés con un conjugado de clorotoxina según se define en las reivindicaciones, que tiene afinidad y especificidad por células que expresan sitios de unión a clorotoxina; y

(b) medir el nivel de unión del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel elevado de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplásico.

En una realización, se proporciona un procedimiento in vitro para detectar células que expresan un complejo de proteína de metaloproteinasa de matriz (MMP-2). El procedimiento incluye las etapas de:

(a) poner en contacto un tejido de interés con un conjugado de clorotoxina según se define en las reivindicaciones que tiene afinidad y especificidad por el complejo de proteína de metaloproteinasa de matriz (MMP-2); y

(b) medir el nivel de unión del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel elevado de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de la presencia de un tumor que expresa el complejo de proteína de metaloproteinasa de matriz (MMP-2)

En una realización, se proporciona un procedimiento in vitro para determinar la localización en un paciente de células cancerosas... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de clorotoxina constituido por uno o más restos Cy5.5 acoplados covalentemente a una clorotoxina.

2. El conjugado de la Reivindicación 1, en el que la clorotoxina se selecciona entre el grupo constituido por clorotoxina natural, clorotoxina sintética, y clorotoxina recombinante.

3. El conjugado de la Reivindicación 1, en el que el conjugado comprende entre 1 y 3 restos Cy5.5.

4. El conjugado de la Reivindicación 1, en el que el conjugado comprende 1 resto Cy5.5.

5. Una composición que comprende un conjugado de clorotoxina según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho conjugado es adecuado para la administración a un ser humano.

6. Un procedimiento in vitro para diferenciar foci de cánceres que expresan sitios de unión a clorotoxina del tejido no neoplásico, que comprende:

(a) poner en contacto un tejido de interés con un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 y que tiene afinidad y especificidad por células que expresan sitios de unión a clorotoxina;

(b) medir el nivel de unión del conjugado de clorotoxina; en el que un elevado nivel de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplásico.

7. Un procedimiento in vitro para detectar cánceres que expresan sitios de unión a clorotoxina, que comprende:

(a) poner en contacto un tejido de interés con un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 y que tiene afinidad y especificidad por células que expresan sitios de unión a clorotoxina; y

(b) medir el nivel de unión del conjugado de clorotoxina; en el que un elevado nivel de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplásico.

8. Un procedimiento in vitro para detectar células que expresan el complejo de proteína de la metaloproteinasa de matriz (MMP-2), que comprende:

(a) poner en contacto un tejido de interés con un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 y que tiene afinidad y especificidad por el complejo de proteína de la metaloproteinasa de matriz (MMP-2); y

(b) medir el nivel de unión del conjugado de clorotoxina;

en el que un elevado nivel de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de la presencia de un tumor que expresa el complejo de proteína de la metaloproteinasa de matriz (MMP-2).

9. Un procedimiento in vitro para determinar la localización en un paciente de células cancerosas que expresan sitios de unión a clorotoxina, que comprende;

medir mediante obtención de imagen de fluorescencia el nivel de unión de un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 en una muestra obtenida del paciente intraquirúrgicamente, para determinar la localización de las células cancerosa que expresan sitios de unión a clorotoxina,

en el que un elevado nivel de unión, con respecto al tejido normal, es indicativo de la presencia de células cancerosas que expresan sitios de unión a clorotoxina.

10. Un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 o una composición según la Reivindicación 5, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa sitios de unión a clorotoxina.

11. Un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 o una composición según la

Reivindicación 5, para uso en el tratamiento de un tumor que expresa el complejo de proteína de la metaloproteinasa de matriz (MMP-2).

12. Un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 o una composición según la Reivindicación 5, para uso en la inhibición de la actividad invasiva de células que expresan sitios de unión a clorotoxina.

13. Un conjugado de clorotoxina según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 o una composición según la Reivindicación 5, para uso en:

(i) la diferenciación de foci de cánceres que expresan sitios de unión a clorotoxina procedentes de tejido no neoplásico;

(ii) la detección de cánceres que expresan sitios de unión a clorotoxina; o

(iii) la determinación de la localización de células cancerosas que expresan sitios de unión a clorotoxina en un paciente intraquirúrgicamente.

14. Los procedimientos de las Reivindicaciones 6, 7 o 9, o el conjugado o la composición de clorotoxina para uso según las Reivindicaciones 10, 12 o 13, en el que el cáncer que expresa sitios de unión a clorotoxina se selecciona entre gliomas, astrocitomas, meduloblastomas, carcinomas del plexo coroideo, ependimomas, tumores cerebrales, neuroblastomas, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de pulmón, cánceres de mama, cánceres de intestino, cánceres de páncreas, cánceres de hígado, cánceres de riñón, sarcomas, osteosarcomas, rabdomiosarcomas, sarcoma de Ewing, carcinomas, melanomas, cánceres de ovarios, cánceres cervicales, cánceres colorrectales, cánceres endometriales, tumores de células germinales, cánceres de laringe, mielomas múltiples, cánceres de próstata, retinoblastomas, cánceres gástricos, cánceres de testículos, y tumor de Wilm.

15. Los procedimientos de las Reivindicaciones 6, 7 o 9, o el conjugado o composición de clorotoxina para uso según las Reivindicaciones 10, 12 o 13, en el que el cáncer que expresa sitios de unión a clorotoxina se selecciona entre gliomas, meduloblastomas, sarcomas, cáncer de próstata, y cáncer de intestino.

16. Un conjugado de clorotoxina según cualquiera de la Reivindicaciones 1-4 o una composición según la Reivindicación 5, para uso en la detección de células que expresan el complejo de proteína de la metaloproteinasa de matriz (MMP-2).