CONFÓRMEROS DE ADHESINAS BACTERIANAS.

La invención se refiere a confórmeros de adhesinas bacterianas aisladas o purificadas, preferentemente con estabilidad y/o inmunogenicidad mejoradas. En un aspecto preferido, la invención comprende un confórmero F de adhesina bacteriana aislada, en el que la adhesina bacteriana aislada es GB580. Antecedentes de la invención E07875131 21-10-2011 Las proteínas son polímeros biológicos que se pliegan en estructuras tridimensionales complejas. La jerarquía clásica de la estructura de las proteínas tiene cuatro niveles que incluyen: (i) la estructura primaria - la secuencia de aminoácidos que constituye la proteína, (ii) la estructura secundaria - la estructura tridimensional local del esqueleto peptídico que puede incluir hélices alfa, láminas beta, hélices 310 y hélices pi, (iii) la estructura terciaria - la estructura tridimensional global de la proteína completa o subunidad de la proteína (es decir, todos los átomos), y (iv) la estructura cuaternaria - la relación tridimensional de subunidades o proteínas en un complejo de proteínas. Cada proteína puede existir en múltiples conformaciones (o "confórmeros") dependiendo de las condiciones locales y los múltiples confórmeros pueden coexistir en equilibrio. El ejemplo más simple de confórmeros de proteínas son las conformaciones plegadas y desplegadas de una proteína. Muchas proteínas tienen múltiples conformaciones plegadas. Por ejemplo, alfa- y beta-tubulina son subunidades que se pueden polimerizar para formar microtúbulos. Esta polimerización cambia la estructura cuaternaria de la tubulina y, por lo tanto, representa un confórmero alternativo de tubulina. Además, determinadas proteínas tienen conformaciones con estructuras secundarias diferentes tales como determinadas proteínas amiloides que se convierten de proteínas solubles con estructura secundaria predominantemente alfa-helicoidal a fibrillas largas, insolubles con estructura secundaria predominantemente beta-laminar. Cuando se purifican proteínas de un organismo huésped, a menudo es difícil separar los diferentes confórmeros de una proteína dado que las propiedades físicas de los diferentes confórmeros son muy similares. Cuando se trata de la expresión de proteínas heterólogas, esto se puede exacerbar por el hecho de que el organismo heterólogo puede carecer de chaperoninas necesarias que ayudan en el plegamiento, de enzimas que modifican post-traduccionalmente la proteína, y otros co-factores que ayudan con la interconversión entre confórmeros, tales como cinasas que añaden grupos fosfato a la proteína para cambiar de una forma inactiva a una activa o viceversa. Los posibles problemas incluyen el mal plegamiento de las proteínas, la inestabilidad, la insolubilidad (formación de los denominados cuerpos de inclusión), y la incapacidad de generar determinados confórmeros sin la co-expresión de co-factores. Incluso cuando el organismo heterólogo puede expresar el confórmero de interés, también puede expresar otros confórmeros que son difíciles de separar del confórmero de interés dadas las propiedades biofísicas similares. La conformación de la proteína es especialmente relevante para la producción de proteínas terapéuticas y proteínas componentes de vacunas. En el descubrimiento temprano del alto rendimiento y en la producción de alto rendimiento de proteínas terapéuticas candidatas o de candidatas para vacunas recombinantes, ya se usan ampliamente sistemas de expresión basados en E. coli. Las principales ventajas de estos sistemas son la velocidad, la simplicidad y el bajo coste de la producción de proteínas recombinantes junto con un conocimiento extenso de los procesos celulares básicos de este huésped. Esto último permite la manipulación fácil de la expresión de proteínas y proporciona los medios para la interferencia operativa para mejorar el rendimiento y la calidad de las proteínas que se van a expresar. Sin embargo, a pesar de lo general, la similitud en la biosíntesis de las proteínas para todas las especies vivas, E. coli no es un huésped universal que pueda producir grandes cantidades de cada proteína derivada de otras especies debido a las diferencias entre la maquinaria traduccional y/o post-traduccional que pueden afectar a las conformaciones de proteínas producidas como se discute anteriormente. Las dificultades en la expresión y en la purificación de proteínas en las conformaciones deseadas son especialmente importantes para proteínas que se van a usar como componentes para vacunas. La antigenicidad de una proteína no depende necesariamente de la estructura tridimensional de una proteína, como cuando se encuentran porciones antigénicas de una proteína en una región de bucle que no depende de la estructura tridimensional global o como cuando la antigenicidad relevante radica en la presentación de fragmentos peptídicos por moléculas MHC. Sin embargo, en algunos casos, las propiedades antigénicas de un antígeno dependen de la forma tridimensional que se puede encontrar sólo en una o en un número limitado de las conformaciones de la proteína. Por lo tanto, para maximizar la antigenicidad de estos componentes de vacunas de proteínas, se necesita identificar la conformación o conformaciones que son las más antigénicas y determinar protocolos para la purificación o el aislamiento de la preparación de la proteína que está enriquecida en la conformación o conformaciones deseadas. Para el desarrollo de vacunas, una clase de antígenos particularmente preferida está representada por la clase de adhesinas. Las adhesinas son un grupo de antígenos expuestos en superficie que están implicados en la adhesión y colonización de tejidos del huésped. Los solicitantes han identificado previamente locus de islas de adhesina dentro del genoma de Streptococcus 2   agalactiae ("GBS"). Los polipéptidos codificados por estos locus son útiles en composiciones para el tratamiento o la prevención de infección por GBS. Se han identificado secuencias similares en otras bacterias Gram positivas y se pueden usar en composiciones inmunogénicas para el tratamiento o la prevención de infección de bacterias Gram positivas. La proteína de superficie de isla de adhesina identificada normalmente está ensamblada en estructuras poliméricas de alto peso molecular tales como pilosidades. GBS 80, una de las adhesinas identificadas en GBS, demostró ser altamente protectora en estudios inmunológicos. El GBS se ha revelado en los últimos 20 años como la causa principal de sepsis neonatal y meningitis que afecta a 0,5-3 de cada 1000 nacidos vivos, y una causa importante de morbilidad entre el grupo de edad avanzada que afecta a 5-8 de cada 100.000 de la población. Las estrategias actuales en la gestión de enfermedades se basan en antibióticos durante el parto y en monitorización neonatal, lo que ha reducido la mortalidad en casos neonatales desde >50% en los años 70 a menos de un 10% en los años 90. Sin embargo, todavía existe una morbilidad y una mortalidad considerables y la gestión es cara. Un 15-35% de las mujeres embarazadas son portadoras asintomáticas y tienen un alto riesgo de transmitir la enfermedad a sus bebés. El riesgo de infección neonatal está asociado con pocos anticuerpos maternos específicos de serotipo y se cree que altas títulos son protectores. Además, la enfermedad invasiva por GBS está cada vez más reconocida en adultos ancianos con enfermedad subyacente, tal como diabetes y cáncer. La "B" en "GBS" se refiere a la clasificación de Lancefield, que se basa en la antigenicidad de un carbohidrato que es soluble en ácido diluido y se denomina el carbohidrato C. Lancefield identificó 13 tipos de carbohidrato C, designados de A a O, que podían diferenciarse serológicamente; los organismos que infectan más comúnmente a seres humanos se encuentran en los grupos A, B, D, y G. Dentro del grupo B, las cepas se pueden dividir, al menos, en 9 serotipos (Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII) basándose en la estructura de cápsula polisacárida. En el pasado, los serotipos Ia, Ib, II, y III eran igualmente frecuentes en el trasporte vaginal normal y en sepsis de inicio temprano en recién nacidos. Sin embargo, el GBS de tipo V se ha revelado como una causa importante de infección por GBS en los Estados Unidos, y las cepas de los tipos VI y VIII se han vuelto frecuentes entre las mujeres japonesas. Se ha publicado la secuencia de genoma de una cepa de serotipo V 2603 V/R (Tettelin y cols. (2002) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 10.1 073/pnas. 182380799) y se han identificado determinados polipéptidos para su uso como antígenos de vacunas (WO02/34771). Sin embargo, actualmente las vacunas en ensayos clínicos se basan en antígenos de polisacáridos. Estos sufren especificidad de serotipo e inmunogenicidad deficiente, por lo que existe una necesidad de proporcionar vacunas eficaces... [Seguir leyendo]

1. Una adhesina bacteriana aislada en el confórmero F, en la que la adhesina bacteriana puede generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, en la que la adhesina bacteriana en el confórmero F no queda retenida por una columna de Q-sefarosa, y en la que la adhesina bacteriana es GBS80. 2. La adhesina bacteriana aislada de la reivindicación 1, en la que la adhesina bacteriana se produce de forma recombinante. 3. La adhesina bacteriana aislada de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que la adhesina bacteriana: a) queda retenida por una columna de hidroxiapatita; b) se desplaza como una única banda con menor peso molecular aparente en SDS-PAGE en ausencia de desnaturalización por calor cuando se compara con la adhesina bacteriana después de la desnaturalización por calor; c) es más resistente a la digestión por proteasas que la adhesina bacteriana en el confórmero A, en la que la adhesina bacteriana en el confórmero A queda retenida por una columna de Q-sefarosa; o d) se eluye desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño como un único pico monodisperso. 4. Un anticuerpo que se une a una adhesina bacteriana en el confórmero F de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, pero no a la adhesina bacteriana en el confórmero A, en el que la adhesina bacteriana en el confórmero A queda retenida por una columna de Q-sefarosa. 5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano. 6. Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5. 7. Una composición que comprende una adhesina bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y que comprende menos del 20% de la adhesina bacteriana en el confórmero A, en la que la adhesina bacteriana en el confórmero A queda retenida por una columna de Q-sefarosa. 8. Una composición que comprende al menos 1 o más partes de GBS80 en el confórmero F a 1 parte de GBS80 en el confórmero A, en la que la GBS80 en el confórmero F puede generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, en la que GBS80 en el confórmero F no queda retenida por una columna de Q-sefarosa, y en la que GBS80 en el confórmero A queda retenida por un columna de Q-sefarosa. 9. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, siendo una composición inmunogénica, una composición de vacuna o una composición de diagnóstico. 10. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-8 para su uso como producto farmacéutico. 11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, para el tratamiento o la prevención de infección por GBS. 12. Un procedimiento de separación de una GBS80 en el confórmero F de una GBS80 en el confórmero A que comprende: a) proporcionar una muestra que contiene una mezcla de la GBS80 en el confórmero F y la GBS80 en el confórmero A; b) separar la GBS80 en el confórmero F de la GBS80 en el confórmero A usando una tecnología de separación seleccionada del grupo que consiste en una tecnología de separación por intercambio aniónico, una tecnología de separación basada en hidroxiapatita y una tecnología de separación basada en el coeficiente de fricción, en el que la GBS80 en el confórmero F no queda retenida por una columna de Q-sefarosa y en el que la GBS80 en el confórmero A queda retenida por una columna de Q-sefarosa. 13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la tecnología de separación basada en el coeficiente de fricción se selecciona del grupo que consiste en electroforesis, cromatografía de exclusión por tamaño, fraccionamiento campo-flujo, centrifugación por velocidad de sedimentación. 66   14. Un procedimiento para aislar el confórmero F de GBS80 que comprende aplicar una muestra que contiene una mezcla de confórmeros sobre una cromatografía de intercambio de iones, recuperar el flujo continuo y aislar el confórmero F con una etapa cromatográfica de hidroxiapatita, en el que la GBS80 en el confórmero F no queda retenida por una columna de Q-sefarosa. 67   Figura 1: SDS-PAGE de isoformas purificadas de GBS 80 68   Figura 2: Filtración en gel analítica en un Superdex 200 10/30 de las mismas muestras con PBS como tampón y un flujo de 0,5 ml/min. 69   Figura 3: Filtración en gel analítica del lote 3 y del lote F a diferentes tiempos y pH.   Figura 4a: Filtración en gel analítica de 5 lotes de GBS 80 diferentes 71   Figura 4b: Pesos moleculares de 5 lotes de GBS80 diferentes como se determina con espectrometría MALDI-TOF. Lote Confórmero principal PM (kDa) Lote 01AK F 52699 Lote 02 K A 52676 Lote 3 A 52733 Lote 4 F 52705 Lote 6 A 52748 72   Figura 5: SDS-PAGE después de la digestión con diferentes proteasas, con y sin desnaturalización con detergente (RapiGest SF). 73   Figura 6: Resultados de inmunización materna activa 74