Mycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética para incluir una proteína endosomalítica que puede expresarse y secretarse que es activa a un pH de 6-8,

en el que la proteína se selecciona del grupo de perfringolisina O, pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, α-hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La invención proporciona cepas de Mycobacterium que tienen una capacidadpotenciada para provocar una respuesta inmunitaria. Experimentos in vivo han demostrado, por ejemplo, una respuesta inmunitaria de células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido. En particular, la invención proporciona cepas de Mycobacterium que expresan una proteínaperfringolisina O (PfoA) que permite el escape del Mycobacterium de los endosomas, y preparaciones de vacuna que contienen las cepas de Mycobacterium.

Antecedentes

Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ha infectado a un tercio de la populación mundial, provocando enfermedad activa en 8 millones y muriendo1,6-2,2 millones de individuos cada año, la mayoría de los cuales viven enpaíses en desarrollo. La tuberculosis (TB) es una epidemia de proporcionesglobales que está creciendo y que se ha vuelto incluso más mortal al cruzarsecon la propagación del VIH. TB es la principal causa de muerte de personas con SIDA.

El bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium bovis y la vacuna frente a la TB ampliamente usada actualmente, se desarrollóhace más de 80 años y cuando se ha sometido a prueba ha tenido tasasampliamente variables de eficacia frente a la tuberculosis pulmonar,incluyendo falta de eficacia en el último gran ensayo de campo realizado enIndia (Fine et al., Vaccine, 16(20):1923-1928; 1998; Anónimo, Indian J MedRes., Aug; 110:56-69; 1999). No obstante, la Organización Mundial de la Saludrecomienda actualmente BCG en el nacimiento o primer contacto con losservicios sanitarios para todos los niños (excepto aquellos con síntomas deenfermedad de VIH/ SIDA) en países con TB extendida. Esta política se basa enla evidencia de que BCG protege frente a formas infantiles graves de TB(Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5):1042-1049; 1995; Rodrigues et al.,J Epidemiol Community Health 45(1): 78-80; 1991). La protección mediante BCG frente a TB más allá de la primera infancia es un objeto controvertido condatos limitados que dan resultados mixtos. La alta incidencia de TB pediátrica y adulta en países en desarrollo donde se practica ampliamente lainmunización con BCG en lactantes, indica sin embargo que BCG tal como seadministra actualmente no es altamente eficaz durante los muchos años en quelas personas están en riesgo de enfermedad de TB. Por tanto, se considera que BCG es una herramienta de salud pública inadecuada para la intervención y elcontrol de la TB.

Aproximadamente el 70 por ciento de los seres humanos expuestos a microorganismos de TB, y que tienen los sistemas inmunitarios normales, nollegan a infectarse, y de los que llegan a infectarse sólo aproximadamente el5 por ciento desarrolla enfermedad en el plazo de los primeros dos años. La mayoría de los individuos infectados eliminan la infección, que está asociadacon el desarrollo de respuestas inmunitarias celulares fuertes frente a antígenos de M. tb. Un 5 por ciento adicional se reactiva posteriormentecuando la inmunidad disminuye. Tanto la enfermedad primaria como la de reactivación son mucho más comunes en personas con VIH/SIDA, lo que pone de relieve de nuevo el papel de la inmunidad en la prevención y el control deinfección.

Puesto que la mayoría de los seres humanos pueden controlar la TB, haybuenos motivos para esperar que mediante la inducción de la inmunidad delarga duración de la clase apropiada, debería ser posible desarrollar vacunas eficaces que previenen la infección inicial tras la exposición, prevenir laevolución temprana de la enfermedad, prevenir la reactivación del estadolatente, y prevenir la recidiva tras el tratamiento. Por último, la combinación del uso de vacuna sistemática más la intervención quimioterápica es lo que eliminará finalmente a M. tb como patógeno humano.

En vista del papel fundamental que se piensa que desempeña la vacunación de BCG infantil en la prevención de TB aguda, es difícil sustituir el BCG enensayos para evaluar vacunas candidatas frente a la TB sin superar laevidencia de que la nueva vacuna frente a la TB sea un producto superior. Elproblema es que M. tb es un patógeno específico de seres humanos y losmodelos animales sólo imitan partes de la interacción huésped-patógeno. Por tanto, la evidencia definitiva de que una nueva vacuna frente a la TB tiene potencia mejorada sólo puede obtenerse a partir de ensayos de campocontrolados en seres humanos. Esta realidad ha llevado a muchos investigadores a concluir que una etapa clave hacia una vacuna frente a la TBmejorada será potenciar la inmunogenicidad de BCG.

Un ejemplo de una estrategia de este tipo es mejorar la capacidad de BCGpara inducir o activar células T para potenciar la respuesta inmunitaria. Elpapel fundamental de las células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido en la inmunidad frente a M. tb se demuestra por la incapacidad de ratones deficientes en 2-microglobulina (2m)para controlar la infección por M. tb experimental (Flynn et al., PNAS USA,89(24): 12013-12017; 1992). El papel fundamental de células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido se demostró de manera convincente por la incapacidad de ratones deficientes en 2microglobulina (2m) para controlar la infección por M. tuberculosis experimental (Flynn et al., citado anteriormente, 1992). Debido a que estosratones mutantes carecen del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, no pueden desarrollarse células T CD8+ funcionales. A diferencia de la infección por M. tuberculosis, los ratones deficientes en 2m pueden controlar determinadas dosis infecciosas de la cepa de vacuna de BCG (Flynn et al.,citado anteriormente, 1992; Ladel C. H., et al., Eur J Immunol, 25: 377-384; 1995). Además, la vacunación de BCG de ratones deficientes en 2m sólo prolonga la supervivencia tras la infección por M. tuberculosis, mientras queC57BL/6 inmunizados con BCG resistieron a M. tuberculosis (Flynn et al.,citado anteriormente, 1992).

Esta dependencia de células T CD8+ diferencial entre M tuberculosis yBCG puede explicarse tal como sigue: los antígenos de M. tuberculosis consiguen mejor acceso al citoplasma que los antígenos de BCG, lo que conducea presentación en complejo mayor de histocompatibilidad de clase I máspronunciada (Hess y Kaufmann, FEMS Microbiol. Immunol 7:95-103; 1993). Porconsiguiente, se genera una respuesta de células T CD8 más eficaz mediante M. tuberculosis. Esta idea se apoyó recientemente por el aumento de la presentación en el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de unantígeno irrelevante, ovoalbúmina, mediante la infección simultánea con M. tuberculosis, en vez de con BCG, de las células presentadoras de antígenos(APC) (Mazzaccaro et al., Proc Natl Acad Sci USA, Oct 15:93(21):11786-91; 1996).

Por tanto, los antígenos de M. tb acceden el citoplasma de la célula huésped mejor que los antígenos de BCG, lo que conduce al aumento de lapresentación en el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Hess et al., citado anteriormente, 1993) y a una respuesta de células T CD8+ elevada frente a M. tb. Además, M. tb estimula las células T CD4+ cooperadoras concomplejo mayor de histocompatibilidad de clase II restringido específicas deantígeno así como las células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido en ratones y seres humanos (Kaufmann, Annu Rev Immunol 11:129-163; 1993). Por extensión, este hechoindica que las células infectadas por M. tb son susceptibles de reconocimiento por las células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor dehistocompatibilidad de clase I restringido. Dado que el 70 por ciento de losseres humanos inmunocompetentes expuestos a los microorganismos de TB nollegan a infectarse, la inmunidad inducida por la infección de M. tb es altamente eficaz en el control de este microorganismo en la inmensa mayoríade los casos. Se cree, por tanto, que la eficacia de la cepa de vacuna de BCGfrente a la TB existente mejorará mediante el aumento de la capacidad de BCGpara inducir respuestas de células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor dehistocompatibilidad de clase I restringido (Kaufmann, Fundamental Immunology,1997).

Como norma, los antígenos expresados por los patógenos que permanecenunido al fagosoma se presentan principalmente por moléculas del complejomayor de histocompatibilidad de clase II a las células T CD4+ pero son poco reconocidas por las células T CD8+, que normalmente reconocen los antígenospresentados en el contexto de... [Seguir leyendo]

1. Mycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética para incluiruna proteína endosomalítica que puede expresarse y secretarse que esactiva a un pH de 6-8, en el que la proteína se selecciona del grupo de

perfringolisina O, pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidos es homólogaen al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

2. Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que dicha proteínaendosomalítica que puede expresarse o secretarse es perfringolisina O ouna variante funcional de la misma que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

3. Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que una secuencia deaminoácidos de dicha proteína endosomalítica que puede expresarse osecretarse se representa mediante SEQ ID NO. 2.

4. Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que dicha proteínaendosomalítica que puede expresarse o secretarse se codifica por unasecuencia génica específica para perfringolisina O o una variantefuncional de la misma que tiene la actividad de la proteína dereferencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un70% a la de la proteína de tipo natural.

5. Mycobacterium según la reivindicación 4, en el que dicha secuenciagénica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO.

3.

6. Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar adicionalmente una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis.

7. Mycobacterium según la reivindicación 6, en el que dicha proteínaapoptótica o dicho potenciador de apoptosis se selecciona del grupo que consiste en caspasa 8, receptor de muerte 5, Fas y proteína de fusiónectodominio de CD4/dominio citoplásmico de FAS.

8. Mycobacterium según la reivindicación 1, modificándose dicho Mycobacterium mediante ingeniería genética para expresar de manerafuncional un gen de interés.

9. Mycobacterium según la reivindicación 1, modificándose dicho Mycobacterium mediante ingeniería genética para expresar de manera funcional

una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis; y

un gen de interés.

10. Mycobacterium según la reivindicación 1, siendo dicho Mycobacterium BCG.

11. Método de permitir que un Mycobacterium escape de endosomas, que comprende la etapa de

modificar mediante ingeniería genética dicho Mycobacterium paracontener, expresar y secretar una proteína endosomalítica que es activaa un pH de 6 a 8, en el que la proteína se selecciona del grupo de

perfringolisina O, pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidoses homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha proteínaendosomalítica es perfringolisina O o una variante funcional de la mismaque tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia deaminoácidos es homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tiponatural.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicha proteínaendosomalítica es una perfringolisina O mutante codificada por SEQ IDNO: 3.

14. Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium es un Mycobacterium atenuado.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicho Mycobacterium atenuado es BCG.

16. Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar adicionalmente unaproteína apoptótica o un potenciador de apoptosis.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicha proteína apoptótica

o dicho potenciador de apoptosis se selecciona del grupo que consiste en caspasa 8, receptor de muerte 5, Fas y proteína de fusión ectodominio de CD4/dominio citoplásmico de FAS.

18. Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar de manera funcionalun gen de interés.

19. Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar de manera funcional

una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis; y

un gen de interés.

20. Preparación de vacuna, que comprende

un Mycobacterium según la reivindicación 1 modificado mediante ingeniería genética para expresar y secretar una proteínaendosomalítica funcional seleccionada del grupo de perfringolisina O,

pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, -hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína dereferencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un70% a la de la proteína de tipo natural, en la que dicha proteínaendosomalítica funcional es activa a pH neutro.

21. Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicha proteína endosomalítica es perfringolisina O.

22. Preparación de vacuna según la reivindicación 21, en la que dicha proteína endosomalítica es una variante funcional de perfringolisina Ocodificada por SEQ ID NO: 3.

23. Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium es un Mycobacterium atenuado.

24. Preparación de vacuna según la reivindicación 23, en la que dicho Mycobacterium atenuado es BCG.

25. Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresaradicionalmente una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis.

26. Preparación de vacuna según la reivindicación 25, en la que dicha proteína apoptótica o dicho potenciador de apoptosis se selecciona del

grupo que consiste en caspasa 8, receptor de muerte 5, Fas y proteína defusión ectodominio de CD4/dominio citoplásmico de FAS.

27. Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresaradicionalmente de manera funcional un gen de interés.

28. Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresaradicionalmente de manera funcional

una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis;

y un gen de interés.

29. Mycobacterium según las reivindicaciones 8 y 9, método según las reivindicaciones 18 ó 19 o preparación de vacuna según las reivindicaciones 27 ó 28, en los que dicho Mycobacterium es una cepa de Mycobacterium atenuada que sobreexpresa un gen de interés que codifica para antígenos de Mycobacterium tuberculosis, seleccionándose en particular dichos antígenos del grupo que consiste en Rv0125, Rv0203,Rv0287, Rv0288, Rv0603, Rv1196, Rv1223, Rv1271c, Rv1733c, Rv1738,Rv1804c, Rv1886, Rv2031c, Rv2032, Rv2253, Rv2290, Rv2389c, Rv2626c,Rv2627c, Rv2779c, Rv2873, Rv2875, Rv3017c, Rv3407, Rv3804c, Rv3810 yRv3841.

30. Mycobacterium según las reivindicaciones 8 y 9, método según las reivindicaciones 18 y 19 o preparación de vacuna según las reivindicaciones 27 ó 28, en los que el Mycobacterium es una cepa de Mycobacterium atenuada que expresa un gen de interés que codifica paraun antígeno parasitario derivado de Plasmodium spp., en particular, de Plasmodium falciparum.