Una bacteria mutante, caracterizada porque la bacteria comprende una cantidad aumentada de folato intracelular y/o extracelular en comparación con el tipo salvaje y tiene una tasa de crecimiento de al menos 0,

1 μ por hora cuando se cultiva en un medio que comprende 1,25 mg/l de metotrexato y que carece de metabolitos dependientes del folato, dichos metabolitos dependientes del folato siendo metabolitos o precursores de la biosíntesis o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al metotrexato de una célula cuando están presentes en el medio circundante

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a unos métodos para seleccionar bacterias mutantes que producen niveles de folato aumentados. En estos métodos el antifolato metotrexato (MTX) se utiliza como agente de selección. También se proporcionan unos alimentos y unas composiciones de suplementos alimentarios que comprenden las bacterias mutantes o derivados o extractos de las bacterias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los análogos del folato y en particular los inhibidores de la dihidrofolato reductasa han sido el tema de investigación durante muchos años debido a su papel potencial en la quimioterapia para el cáncer y como agentes contra el parásito de la malaria. Uno de los primeros análogos del folato descritos en la literatura es el metotrexato de los laboratorios Lederle. Este compuesto ya se ha utilizado en 1948 para el tratamiento de la leucemia aguda (Hitchings, g. H., Jr., 1989, In Vitro Cell Dev Biol 25:303-10).

La actividad del metotrexato (MTX) se basa en la inhibición competitiva de la enzima diana dihidrofolato reductasa. Esta enzima es necesaria para la producción y el reciclaje del tetrahidrofolato (THF) que utiliza dihidrofolato (DHF) como sustrato. La especificidad del metotrexato puede explicarse por pequeñas diferencias estructurales de las dihidrofolato reductasas en diferentes especies (Chang et al., 1978, Nature 275:617-24). El metotrexato impide que las células produzcan suficiente tetrahidrofolato para la biosíntesis de metionina, ADN y ARN. Sin embargo en presencia de purinas, timidina, glicina, metionina y ácido pantoténico (todos ellos metabolitos que necesitan tetrahidrofolato para su propia biosíntesis) puede disminuir la demanda de las células para sintetizar tetrahidrofolato (Harvey, R. J., 1973, J Bacteriol 114:309-22). Sin embargo las células verán siempre de alguna forma obstaculizado su crecimiento por el MTX, porque el THF es esencial para la formación de metionil-RNAtfmet, un compuesto que es indispensable para la iniciación de la síntesis de proteínas, independientemente de la presencia de metabolitos dependientes del folato (Baumstark et al., 1977, J Bacteriol 129:457-71).

Las bacterias del ácido láctico como Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei muestran un alto grado de variabilidad en su respuesta al metotrexato y a otro análogo del folato, el trimetoprim. Se sabe que L. lactis es insensible a ambos antifolatos (Leszczynska et al., 1995, Appl Environ Microbiol 61:561-6). Se ha demostrado para numerosos organismos que una exposición prolongada a antifolatos resulta en una selección de tipos de células resistentes. Se han descrito varios mecanismos subyacentes para explicar el mecanismo de resistencia tanto de líneas de células eucariotas como de bacterias al metotrexato (MTX). Tamura et al. (1997, Microbiology 143: 2639-46) investigaron los mecanismos que llevaban a la resistencia al MTX en Enterococcus hirae. Descubrieron varios efectos fenotípicos que incluían (i) actividad aumentada de la reductasa del ácido fólico (FAR) (ii) dihidrofolato reductasa aumentada (DHFR), (iii) disminución de la síntesis y retención intracelular del MTX que contenía dos residuos glutamil, (iv) disminución de la captación de MTX acompañada de la disminución de la captación de los folatos; y (v) reducción de la capacidad de unión al folato. La forma de folato presente en el medio durante el desarrollo de la resistencia influía en las actividades DHFR y FAR y en el transporte de los folatos.

Sin embargo, aunque se sabe que la exposición a MTX puede utilizarse para seleccionar células con una resistencia aumentada al MTX, no se ha descrito ningún vínculo entre resistencia al MTX y niveles de folato de las células en la técnica anterior. A diferencia de los mecanismos de resistencia al MTX descritos anteriormente, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que las células bacterianas tienen otra manera de generar resistencia al MTX. Este mecanismo es la producción de niveles de folato altos. Este hallazgo puede ser aprovechado en el cribado y selección de bacterias mutantes (espontáneas) que producen niveles de folato altos, mediante el uso de metotrexato como agente de selección. Tales bacterias, especialmente bacterias de uso alimentario, pueden utilizarse para enriquecer productos alimentarios con folato. El folato es una vitamina B soluble, necesaria para el buen crecimiento y funcionamiento celular. Muchos productos alimentarios, como el pan, cereales, productos lácteos, etc. se complementan con ácido fólico para garantizar una ingesta adecuada de folato. Las bacterias mutantes de la presente invención posibilitan el enriquecimiento de productos alimentarios con folato natural mediante por ejemplo la fermentación utilizando las bacterias mutantes.

DEFINICIONES

"Bacterias del ácido láctico" como se utiliza en la presente memoria, son bacterias, que producen ácido láctico como producto final de la fermentación, tales como las bacterias del género Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus y Bifidobacterium.

Una "cepa" o un "aislado" bacteriano se utilizan en la presente memoria indistintamente y se refieren a una bacteria que no cambia genéticamente al crecer o multiplicarse. Se incluyen la multiplicidad de bacterias idénticas.

Una "bacteria mutante" o una "cepa o aislado bacteriano mutante" se refiere a una bacteria mutante natural (espontánea, natural) o a una bacteria mutante inducida que comprende una o más mutaciones en su genoma (ADN) que están ausentes en el ADN de tipo salvaje. Un "mutante inducido" es una bacteria donde la mutación fue inducida por el tratamiento humano, tales como el tratamiento con mutágenos químicos, radiación UV o gamma, etc. Por el contrario, un "mutante espontáneo" o "natural" no ha sido mutagenizado por el hombre. Las bacterias mutantes en la presente memoria son no-GMO, es decir, no modificadas por la tecnología del ADN recombinante.

"Cepa de tipo salvaje" o "aislado de tipo salvaje " se refiere a la forma no mutada de una bacteria, tal como se encuentra en la naturaleza.

"Metabolitos dependientes del folato" se refiere a metabolitos o precursores de la biosíntesis o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al MTX de una célula cuando están presentes en el medio circundante. "Cantidad inhibitoria de MTX" se refiere a la cantidad requerida para prácticamente inhibir el crecimiento de una célula. Por lo general, para las células procariotas una cantidad de al menos aproximadamente 1,25 mg/L de medio de cultivo es inhibitoria para las células sensibles al MTX. "Folato total" se refiere a los niveles de folato extracelular (secretados) e intracelular producidos por una cepa.

Microorganismos "de uso alimentario" son en particular organismos, que se consideran como no peligrosos, cuando son ingeridos por un sujeto humano o animal.

La expresión "que comprende" se interpreta como especificando la presencia de las partes, etapas o componentes indicados, pero no excluye la presencia de una o más partes, etapas o componentes adicionales. Una composición que comprende la cepa bacteriana X, puede por lo tanto comprender cepas adicionales, otros componentes, etc. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" por tanto significa normalmente "al menos uno".

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y REALIZACIONES PREFERIDAS

Mientras se sometía a ensayo si las bacterias recombinantes sobreproductoras de folato han modificado su susceptibilidad al MTX, se descubrió que un número de cepas de tipo salvaje de L. plantarum, que fueron incubadas durante más de aproximadamente 40 horas en cantidades inhibitorias de MTX (1,25 mg/L) no fueron inhibidas por el MTX, sino que tuvieron una tasa de crecimiento similar a la del medio que carecía de MTX. Al analizar los niveles de folato de estas cepas, aproximadamente el 5% de estas colonias mostraron una producción de folato significativa mayor en comparación con la cepa de tipo salvaje (no mutada). Los pools de folato total fueron 4% a 63% superiores en comparación con los niveles de tipo...

1. Una bacteria mutante, caracterizada porque la bacteria comprende una cantidad aumentada de folato intracelular y/o extracelular en comparación con el tipo salvaje y tiene una tasa de crecimiento de al menos 0,1 μ por hora cuando se cultiva en un medio que comprende 1,25 mg/l de metotrexato y que carece de metabolitos dependientes del folato, dichos metabolitos dependientes del folato siendo metabolitos o precursores de la biosíntesis

o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al metotrexato de una célula cuando están presentes en el medio circundante.

2. La bacteria según la reivindicación 1, en la que dicha bacteria es un mutante natural o un mutante inducido.

3. La bacteria según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha bacteria muestra sobreexpresión en comparación con el tipo salvaje de uno o más genes que codifican para enzimas de la vía de la biosíntesis del folato.

4. La bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la expresión de uno o más de los genes seleccionados de los genes que codifican para la dihidrofolato sintasa, fructoquinasa, piruvato oxidasa y 6-fosfo-β-glucosidasa están sobrerregulados al menos aproximadamente 2 veces más en comparación con el tipo salvaje.

5. La bacteria según la reivindicación 1, 2 ó 4, en la que la expresión del gen que codifica para la dihidroxiacetona fosfotransferasa está infrarregulado al menos aproximadamente 2 veces en comparación con el tipo salvaje.

6. La bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la cantidad de folato total de la bacteria mutante es al menos un 10% superior que la de la cepa de tipo salvaje.

7. La bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la bacteria es de las especies Lactobacillus plantarum, L. casei, L. reuteri, L. fermentum,

L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. murinus, L. jensenii,

L. salivarius, L. minutis, L. brevis, L. gallinarum, L. amylovorus, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Lc. lactis, Pediococcus damnosus,

P. acidilactici, P. parvulus, Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. infantis, B. breve,

B. adolescente, B. animalis, B. gallinarum, B. magnum y B. thermophilum.

8. Lactobacillus plantarum cepa CBS 117120.

9. Una composición que comprende una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. La composición según la reivindicación 9, en la que la composición es una composición alimentaria o una composición de suplemento alimentario.

11. La composición según la reivindicación 10 en la que la composición alimentaria es una composición alimentaria fermentada.

12. Uso del metotrexato para la selección de bacterias que tienen unos niveles de folato total aumentados e intracelular aumentados.

13. Un método para seleccionar bacterias que tienen unos niveles de folato total y/o intracelular aumentados, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) cultivar las bacterias sobre o en un medio que comprende metotrexato, en el que el medio no se complementa con metabolitos dependientes del folato, dichos metabolitos dependientes del folato siendo metabolitos o precursores de la biosíntesis o del catabolismo del folato que son capaces de enmascarar la sensibilidad al metotrexato de una célula cuando están presentes en el medio circundante,

(b) seleccionar las bacterias que tienen una tasa de crecimiento (μ) de al menos 0,1 por hora,

(c) determinar el nivel de folato de las bacterias seleccionadas en la etapa (b) y elegir las bacterias de tener niveles de folato aumentados en comparación con el tipo salvaje,

(d) opcionalmente repetir las etapas (a), (b) y/o (c).

14. El método según la reivindicación 13, en el que dicho medio comprende al menos 1,25 mg/l de metotrexato y en el que las bacterias se cultivan sobre dicho medio durante al menos 40 horas.