Arabinofuranosidasa la cual es: a) un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID nº:

2 o b) un análogo del polipéptido definido en (a) el cual: i) tiene al menos un 80% de identidad con dicho polipéptido, o ii) es una variante alélica de dicho polipéptido

Arabinofuranosidasas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados teniendo actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa y secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificando los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Las arabinofuranosidasas son capaces de hidrolizar residuos de alfa-L-arabinofuranosida terminales no reductores en alfa-L-arabinosidas y se clasifican como EC 3.2.1.55. Las arabinofuranosidasas se han aislado a partir de diferentes organismos incluyendo hongos filamentosos. No obstante, se conocen muy pocas alfa-arabinofuranosidasas capaces de liberar arabinosa a partir de xilosas di-sustituidas. Se ha descrito una enzima intracelular de Bifidobacterium adolescentis capaz de liberar arabinosa a partir de C3 de xilosa di-sustituida (también internamente) (Van Laere, 1997, Appl. Microbiol. Biotechnol, 47, 231-235 y Van den Broek, 2005, Applied Microbiology and Biotechnology). A partir de cebada se ha aislado una enzima activa en xilosas mono- y terminalmente di-sustituidas, pero ésta tiene poca actividad en xilosas internamente di-sustituido (Ferre, 2000, Eur. J. Biochem., 267, 6633-6641). Una enzima de Trichoderma reesei es posiblemente activa en residuos terminalmente di-sustituidos (actividad vista en 3,5-di-O-alfa-Larabinofuranosil-alfa-L-arabinofuranosida), pero no tiene actividad hacia un oligo-sustrato con arabinosa C3 internamente sustituida (Nogawa, 1999, Appl. CircundarEnviron. Microbiol., 65, 3964-3968).

Una comparación de secuencias del estado anterior de la técnica en toda su longitud muestra que la secuencia de aminoácidos maduros mostrada en la SEC ID NO:2 tiene un 72% de identidad con una secuencia de aminoácidos de Chaetomium globosum, y la secuencia de ADN correspondiente en la SEC ID NO:1 muestra un 73% de identidad con los de la secuencia de ADN de Chaetomium globosum correspondiente. La identidad entre la secuencia mostrada en la SEC ID NO:2 y la alfa-L-arabinofuranosidasa GH43 bacteriana de Bifidobacterium sp. es del 25%.

Resumen de la invención

Los inventores han aislado una alfa-L-arabinofuranosidasa de una cepa de la Humicola insolens de hongos filamentosos (SEC ID NO:2). Los inventores también aislaron el gen que codifica la alfa-L-arabinofuranosidasa nueva. La enzima es extracelular y pertenece a GH43.

La alfa-L-arabinofuranosidasa de Humicola insolens es capaz de liberar arabinosa a partir de xilosas di-sustituidas, es decir la alfa-L-arabinofuranosidasa es activa en unidades de xilosa de arabinoxilano de trigo con arabinosa fijada a C2 y C3. La actividad hacia xilosas di-sustituidas es esencial para la hidrólisis total de arabinoxilano a monosacáridos por ejemplo en la producción de etanol a partir de biomasa.

Por consiguiente, en un primer aspecto la invención proporciona una arabinofuranosidasa la cual es: (a) un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID nº: 2 o (b) un análogo del polipéptido definido en (a) el cual: (i) tiene al menos un 80% de identidad con dicho polipéptido, (ii) o es una variante alélica de dicho polipéptido. Por consiguiente, en un segundo aspecto la invención proporciona una secuencia de ácidos nucléicos teniendo al menos un 80% de identidad con las secuencias de ADN mostradas en la SEC ID NO:1, o (a) es una variante alélica de la SEC ID NO:1, o (b) una cadena complementaria a a).

Por consiguiente, en un tercer aspecto la invención proporciona un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos del segundo aspecto operativamente vinculada a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la arabinofuranosidasa en un huésped de expresión adecuado.

En un cuarto aspecto la invención proporciona un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucléicos del tercer aspecto.

En un quinto aspecto la invención proporciona una célula huésped recombinante comprendiendo el vector de expresión del cuarto aspecto.

En un sexto aspecto la invención proporciona un método para la producción de una arabinofuranosidasa comprendiendo cultivar la célula huésped del quinto aspecto bajo condiciones propicias para la producción de la arabinofuranosidasa, y recuperar la arabinofuranosidasa.

En un séptimo aspecto la invención proporciona una composición comprendiendo la arabinofuranosidasa según el primer aspecto.

En otros aspectos la invención proporciona usos de las arabinofuranosidasas del primer aspecto ss en una masa, en la producción de etanol combustible a partir de celulosa conteniendo biomasa o en la producción de etanol combustible y/o potable a partir de almidón, en un proceso de maceración, o en un proceso para producir un producto alimenticio.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1A-C muestra polímeros de arabinoxilano.

Fig. 1A muestra arabinoxilano intacto.

Fig. 1B muestra arabinoxilano di-sustituido.

Fig. 1C muestra arabinoxilano sustituido individualmente.

Fig. 2A-C muestra arabinoxilo-oligosacáridos.

Fig. 2A muestra grupos de arabinosilo vinculados a C-3 interno.

Fig. 2B muestra grupos de arabinosilo vinculados a C-3 terminal.

Fig. 2C muestra grupos de arabinosilo vinculados a C-2 interno.

Descripción detallada de la invención

En una forma de realización del segundo aspecto de la presente invención, el polipéptido aislado tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1 a 558 de la SEC ID NO:2. En una forma de realización interesante de la invención el polipéptido tiene al menos un 75%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1 a 558 de la SEC ID NO:2.

En una forma de realización del segundo aspecto de la invención, el polipéptido aislado es una alfa-L-arabinofuranosidasa capaz de liberar arabinosa a partir de xilosas di-sustituidas, por ejemplo la alfa-L-arabinofuranosidasa es activa en unidades de xilosa de arabinoxilano de trigo con arabinosa fijada a C2 y C3.

Los alineamientos de secuencias y el cálculo de identidad se pueden determinar adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se usan los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de aminoácidos: penalización de creación de GAP de 3.0 y penalización de extensión de GAP de 0.1. La parte relevante de la secuencia de aminoácidos para la determinación de identidad es el polipéptido maduro, es decir sin el péptido señal.

Preferiblemente, los polipéptidos de la presente invención comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas como los aminoácidos 1 a 558 de la SEC ID NO:2, una variante alélica de lo mismo, o un fragmento de lo mismo que tenga actividad de arabinofuranosidasa. Obviamente, el polipéptido de la invención también puede consistir en las secuencias de aminoácidos mostradas como los aminoácidos 1 a 558 de la SEC ID NO:2.

Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen ocupando la misma localización cromosómica. Una variación alélica surge naturalmente a través de una mutación, y pueden suponer polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos teniendo secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Los polipéptidos también pueden ser variantes alélicas o fragmentos de los polipéptidos que tengan actividad de arabinofuranosidasa.

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1. Arabinofuranosidasa la cual es: