ANTICUERPOS PARA INHIBIR LA ACTIVIDAD DE MMP-2 Y MMP-9.

La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que inhiben la actividad de MMP-2 y MMP-9 usados para tratar cáncer metastásico como se caracteriza en las reivindicaciones. Las metaloproteínas de matriz (MMP) son enzimas clave que participan en la remodelación de la matriz extracelular (MEC). Estas enzimas son capaces de destruir una variedad de componentes de tejido conjuntivo de cartílago articular o membranas basales. La familia de genes de MMP humanos consiste en al menos 28 proteínas estructuralmente relacionadas (véase la figura 1), que comparten una topología esférica global similar (figura 2 y Borkakoti, 1998). Cada MMP se secreta como una proenzima inactiva, latente. El dominio de zinc catalítico está compuesto de alrededor de 180 aminoácidos en donde la secuencia altamente conservada HE-GH-LGL-H proporciona los tres residuos de histidina (es decir, H) que se unen al ión metálico Zn(2+). El cuarto sitio de unión del ión de zinc catalítico en la proenzima se une a un residuo de cisteína (Morgunova et al., 1999), que tras la activación de la enzima se disocia del sitio activo (Van Wart y Birkedal-Hansen, 1990). Como resultado, el cuarto sitio de unión en las MMP activadas lo ocupa una molécula de agua, que también está unida por puentes de hidrógeno a un residuo conservado de glutámico. Este proceso facilita la hidrólisis de un enlace peptídico del sustrato diana con la molécula de agua activada. La rotura incontrolada de tejido conjuntivo por metaloproteasas es una característica de muchas afecciones patológicas, probablemente resultante de un exceso de actividad MMP o de una relación desequilibrada entre los inhibidores tisulares naturales de MMP (TIMP) y las MMP. Los TIMP inhiben las MMP mediante la formación de complejos estequiométricos con el sitio activo de unión a zinc de las MMP (Gomez et al., 1997; Henriet at al., 1999; Bode et al., 1999; Will et al., 1996). Cuando los niveles de los TIMP son insuficientes, una degradación lenta progresiva de la MEC puede producir la pérdida de matriz cartilaginosa en artritis reumatoide (Walakovits et al., Arthritis Rheum, 35:35-42, 1992) y artrosis (Dean et al., J. Clin. Invest. 84:678-685, 1989) o degradación de matriz ósea (Hill et al., Biochem. J. 308: 167-175, 1995). En otras situaciones, tal como insuficiencia cardiaca congestiva, se puede producir la degradación rápida de la MEC del corazón (Armstrong et al., Canadian J. Cardiol. 10: 214-220, 1994). Otras afecciones patológicas, que también están relacionadas con la actividad no regulada de las MMP, incluyen la remodelación rápida de la MEC por células tumorales metastásicas. En tales afecciones las MMP activadas o bien se expresan por las células cancerosas o por los tejidos circundantes. Hay evidencia considerable de que las MMP están implicadas en el crecimiento y expansión de tumores (por ejemplo, véase, Davidson et al., Chemistry & Industry, 258-261, 1997, y las referencias en dicho documento). En el proceso de metástasis tumoral, las MMP se usan para romper la MEC, lo que permite que las células cancerosas del tumor primario invadan vasos sanguíneos próximos donde se transportan a diferentes órganos y establecen tumores secundarios. El crecimiento invasivo en estos sitios secundarios está mediado por las MMP, que rompen el tejido. Además, la actividad MMP contribuye al crecimiento hacia dentro de nuevos vasos sanguíneos, también denominado angiogénesis, que se requiere para que los tumores crezcan por encima de un cierto tamaño. Dado el amplio papel de las MMP en fisiología y patología humanas, no es sorprendente que se hayan efectuado numerosos esfuerzos para diseñar fármacos, que inhiban la actividad excesiva de las MMP. Los esfuerzos del descubrimiento de fármacos se han enfocado sobre clases de inhibidores que contienen un grupo funcional que coordina el ión de zinc para de esta manera inactivar la MMP diana. Una de tales clases de inhibidores es la de inhibidores hidroxamato, pequeños análogos peptídicos de colágenos fibrilares, que específicamente interaccionan de una manera bidentada a través de los oxígenos de hidroxilo y carbonilo del grupo hidroxámico con el ión de zinc en el sitio catalítico [Grams et al., (1995), Biochem. 34: 14012-14020; Bode et al., (1994), EMBO J., 13: 1263-1269]. Los inhibidores de MMP basados en hidroxamato habitualmente están compuestos de un esqueleto carbonado (documentos WO 95/29892, WO 97/24117, WO 97/49679 y EP 0780386), un esqueleto peptídico (documentos WO 90/05719, WO 93/20047, WO 95/09841 y WO 96/06074) o un esqueleto peptidomimético [Schwartz et al., Progr. Med. Chem., 29: 271-334(1992); Rasmussen et al., Pharmacol. Ther., 75: 69-75 (1997); Denis et al., Invest. New Drugs, 15: 175-185 (1997)]. De forma alternativa, contienen un grupo sulfonamido sulfonilo que está unido en un lado a un anillo de fenilo y un nitrógeno sulfonamido que está unido a un grupo hidroxamato a través de una cadena de uno a cuatro átomos de carbono (documento EP 0757984 A1). Otros inhibidores de MMP basados en péptidos son tiolamidas que muestran actividad de inhibición de colagenasa (patente de EE UU No. 4.595.700), derivados N-carboxialquilo que contienen una bifeniletilglicina que inhiben MMP- 2   3, MMP-2 y colagenasa (Durette et al., WO 9529689), derivados lactamas que inhiben las MMP, TNF-alfa y agrecanasa (véase US 6.495.699) y compuestos tricíclicos de sulfonamida (véase US 6.492.422). Aunque los inhibidores de MMP basados en péptidos tienen un potencial terapéutico claro su uso en terapia clínica está limitado. Los hidroxamatos basados en péptidos son caros de producir y tienen baja estabilidad metabólica y biodisponibilidad oral [por ejemplo, batimastat (BB-94)]. Estos compuestos de glucuronidan con rapidez, se oxidan a ácido carboxílico y se excretan en la bilis [Singh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 337-342, 1995; Hodgson, Remodelling MMPIs, Biotechnology 13: 554-557, 1995)]. Además, los inhibidores de MMP basados en péptidos con frecuencia muestran los mismos efectos inhibidores o similares contra cada una de las enzimas MMP. Por ejemplo, se ha descrito que batimastat muestra valores de CI50 de alrededor de 1 hasta alrededor de 20 nM contra cada una de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 y MMP-9 [Rasmussen et al., Pharmacol. Ther., 75(1): 69-75 (1997)]. Además el uso de varios inhibidores hidroxamatos se asoció con efectos secundarios graves tales como problemas muscoesqueléticos con marimastat (BB-2516), exantema maculopapular extendido con CGS27023A (Novartis) [Levitt et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7: 1912-1922] y anormalidades hepáticas, anemia, dolor en el hombro y espalda, trombocitopenia, nausea, fatiga, diarrea y trombosis profunda de vena con BAY12-9566 (Bayer) [Heath et al., 2001, Cancer Chemother. Pharmacol. 48: 269-274]. Además, ensayos clínicos de fase III en pacientes de cáncer avanzado con marimastat, prinomastat (AG 3340, Agouron) y Bay 12-9566 no demostraron eficacia clínica en inhibir metástasis (Zucker et al., 2000, Oncogene 19: 6642-50). Otros inhibidores de MMP son las tetraciclinas no microbianas químicamente modificadas (CMT) que se mostró que bloqueaban la expresión de varias MMP in vitro. Sin embargo, se encontró que la eficacia in vivo de estos compuestos era limitada, por ejemplo, el inhibidor CMT, doxiciclina, redujo los niveles tisulares de MMP-1 pero no de MMP-2, -3 o -9 en placas carótidas ateroescleróticas en pacientes humanos (Axisa et al., 2002, Stroke 33: 2858- 2864). Recientemente, se diseñó un inhibidor de MMP basado en mecanismo, SB-3CT, según la información cristalográfica de rayos X del sitio activo de MMP (Brown et al., 2000). Los estudios de absorción de rayos X revelaron que la unión de esta molécula al zinc catalítico reconstruye el medio conformacional alrededor del ión metálico del sitio activo de vuelta al de la proenzima [Kleifeld et al., 2001, J Biol. Chem. 276: 17125- 31]. Sin embargo, la eficacia terapéutica obtenida con este agente aún se debe determinar. Otra clase de inhibidores naturales son anticuerpos monoclonales. Se han producido varios anticuerpos contra secuencias peptídicas específicas en el dominio catalítico de MMP-1 (Galvez et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 37491-37500). Sin embargo, aunque estos anticuerpos pudieron inhibir la actividad in vitro de MMP, aún no se han demostrado resultados que demuestren la eficacia in vivo de tales anticuerpos. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, el sitio catalítico de las MMP incluye un ión metálico coordinado que se vuelve disponible para la unión al sustrato después de la activación de la enzima (véanse las figuras 2a-c). Por tanto, es concebible que los anticuerpos convencionales dirigidos a la secuencia primaria de aminoácidos de la enzima no distinguirían la forma activa de la forma inactiva... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para su uso en el tratamiento de un cáncer metastásico, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región de reconocimiento del antígeno capaz de unirse tanto al ión metálico como a los aminoácidos de coordinación en el sitio de zinc catalítico de una metaloenzima, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo inhibe la actividad de MMP-2 y MMP-9. 2. Uso de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer metastásico, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región de reconocimiento del antígeno capaz de unirse tanto al ión metálico como a los aminoácidos de coordinación en el sitio de zinc catalítico de una metaloenzima, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo inhibe la actividad de MMP-2 y MMP-9. 3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o el uso según la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o el uso según la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.   26   27   28   29     31   32   33   34