ANTICUERPOS PARA EL RECEPTOR DE ERITROPOYETINA Y USOS DE LOS MISMOS.

Anticuerpos para el receptor de eritropoyetina y usos de los mismos Descripción Antecedentes de la invención ES 2 365 924 T3 La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína que es el principal regulador de la eritropoyesis. Específicamente, Epo es responsable de promover el crecimiento, diferenciación y supervivencia de progenitores eritroides, lo que da lugar a glóbulos rojos maduros. En respuesta a cambios en el nivel de oxígeno en la sangre y tejidos, la eritropoyetina parece estimular tanto la proliferación como la diferenciación de eritroblastos inmaduros. También actúa como un factor de crecimiento, estimulando la actividad mitótica de células progenitoras eritroides, tales como unidades formadoras de colonias y formadoras de estallido eritroide. También actúa como un factor de diferenciación, desencadenando la transformación de una unidad formadora de colonias de eritrocitos en un proeritoblasto (Véase Erslev, A., New Eng. J. Med., 316: 101-103 (1987)). Epo tiene un peso molecular de aproximadamente 34.000 Daltons y puede aparecer en tres formas - alfa, beta y asialo. Durante la fase media y la fase tardía de la gestación, la Epo se sintetiza en el hígado fetal. Posteriormente, la Epo se sintetiza en el riñón, circula en el plasma y se excreta en la orina. Se ha aislado y purificado Epo urinaria humana (véase, Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5558 (1977)). Además, se conocen en la técnica métodos para identificar, clonar y expresar genes que codifican Epo (véase la Patente de Estados Unidos 4.703.008) así como que purifican Epo recombinante a partir de un medio celular (véase la Patente de Estados Unidos 4.667.016). La actividad de Epo está mediada por la unión y activación de un receptor de la superficie celular denominado receptor de eritropoyetina (EpoR). El receptor de Epo pertenece a la superfamilia de receptores de citocinas y se cree que contiene al menos dos polipéptidos distintos, una especie de 55-72 kDa y una especie de 85-100 kDa (véase la Patente de Estados Unidos 6.319.499, Mayeux et al., J. Biol. Chem, 266: 23380 (1991), McCaffery et al., J. Biol. 6.319.499, Mayeux et al., J. Biol. Chem, 266:23380 (1991), McCaffery et al., J. Biol. Chem., 264: 10507 (1991)). Otros estudios han revelado otros complejos polipeptídicos de receptor de Epo que tienen pesos moleculares tales como 110, 130 y 145 kDa (véase la Patente de Estados Unidos 6.319.499). Se han clonado y expresado los receptores de Epo tanto murinos como humanos (véase DAndrea et al., Cell, 57: 277 (1989); Jones et al., Blood, 76: 31 (1990); Winkelmarm et al., Blood, 76: 24 (1990); documento WO 90/08822/Patente de Estados Unidos 5.278.065). El receptor de Epo humano de longitud completa es una proteína transmembrana de 483 aminoácidos con un péptido señal de aproximadamente 25 aminoácidos (véase la Patente de Estados Unidos 6.319.499). El receptor humano demuestra aproximadamente un 82% de homología de secuencia de aminoácidos con el receptor murino. Misma referencia. En ausencia de ligando, el receptor de Epo existe en un dímero preformado. La unión de Epo a su receptor provoca un cambio conformacional de modo que los dominios citoplasmáticos se colocan en proximidad cercana. Aunque no se entiende completamente, se cree que esta dimerización desempeña un papel en la activación del receptor. La activación del receptor de Epo da como resultado varios efectos biológicos. Algunas de estas actividades incluyen la estimulación de la proliferación, la estimulación de la diferenciación y la inhibición de la apoptosis (véase la Patente de Estados Unidos 6.319.499, Liboi et al., PNAS USA, 90: 11351 (1993), Koury, Science: 248: 378 (1990)). Es la relación entre la dimerización del receptor de Epo y la activación la que puede usarse para identificar compuestos (es decir, tales como anticuerpos) distintos de Epo que sean capaces de: (1) dimerizar el receptor de Epo; y (2) activar al receptor. Estos compuestos serían útiles en el tratamiento de mamíferos que padecen anemia y en la identificación de mamíferos que tienen un receptor de Epo disfuncional. En el documento WO 96/40231 se describe un método para generar anticuerpos que son agonistas de receptores. Por ejemplo, se describe un anticuerpo agonista de Epo que puede usarse en el tratamiento de anemia. El documento WO 99/55369 describe anticuerpos que tienen inmunogenicidad reducida en seres humanos y métodos para su preparación que comprenden injertos de CDR de anticuerpos donadores de una especie no humana. Por ejemplo, se describe la preparación de un anticuerpo anti-receptor de Epo por injerto de CDR de un anticuerpo donador murino en un anticuerpo aceptor de primate no humano. En el documento WO 97/048729 se describe un anticuerpo que activa los receptores de Epo y es útil para tratar trastornos relacionados con la activación del receptor de Epo. Por ejemplo, se describe que el anticuerpo MAb34 es capaz de unirse al receptor de Epo y muestra una Koff de 1,7 x 10 -2 s -1 . El documento WO 04/035603 se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen y activan un receptor 2 de Epo, tal como el anticuerpo Ab 198 que tiene una Kd de 13,9 nM. Sumario de la invención ES 2 365 924 T3 La invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se disocia del receptor de eritropoyetina humano (EpoR) con una constante de velocidad Koff mayor de aproximadamente 1,3 x 10 -3 s -1 y que activa una actividad endógena de dicho EpoR en un mamífero, comprendiendo dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera, en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de Fórmula I: Q-V-Q-L-Q-E-S-G-P-G-L-V-K-P-S-E T-L-S-L-T-C-T-V-S-G-A-S-I-S-S-Y Y-W-S-W-I-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-I G-Y-I-X1-X2-X3-G-S-T-N-Y-N-P-S-L-K S-R-V-T-I-S-V-D-T-S-K-N-Q-F-S-L K-L-R-S-V-T-A-A-D-T-A-V-Y-Y-C-A R-E-R-L-G-I-G-D-Y-W-G-Q-G-T-L-V T-V-S-S (SEC ID Nº: 15) en la que X1 se selecciona independientemente del grupo consistente en tirosina (Y), glicina (G) y alanina (A); X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en tirosina (Y), glicina (G), alanina (A), glutamina (E) y ácido aspártico (D); y X3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en serina (S), glicina (G), glutamina (E) y treonina (T) con la condición de que X1-X2-X3 sea distinto de Y-Y-S, y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17. Los anticuerpos de la invención se caracterizan por la unión a EpoR con baja afinidad y la disociación de receptor de eritropoyetina humana (EpoR) con una velocidad de disociación rápida. Los anticuerpos o parte de unión a antígeno de los mismos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, una IgG2) o pueden comprender solamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un F(ab)2). En una realización preferida, los anticuerpos de la invención se unen a EpoR con una Kd de aproximadamente 7 nM o mayor. En una realización más preferida, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se une a EpoR con una Kd de aproximadamente 8,5 nM o mayor. En una realización aún más preferida, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se une a EpoR con una Kd de aproximadamente 20 nM y, más preferiblemente, con una Kd de aproximadamente 32 nM. En una realización más preferida, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se disocia de EpoR con una de constante de velocidad Koff seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1,4 x 10 -3 s -1 o mayor, aproximadamente 1,9 x 10 -3 s -1 y aproximadamente 4,8 x 10 -3 s -1 según se determina por resonancia de plasmón superficial. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal. En una realización preferida, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo es un isotipo IgG2. En una realización adicional, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humano. En otra realización, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo tiene una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14. Otro aspecto de la invención se refiere al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la presente descripción para activar una actividad endógena de un receptor de eritropoyetina humano para tratar anemia, hipoxemia, hipoxia tisular crónica, insuficiencia cardiaca, enfermedad cardiaca isquémica, insuficiencia renal, daño de células neurales o daño de tejido neural, o para promover la curación de heridas en un mamífero, mediante la administración al mamífero de una cantidad... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se disocia del receptor de eritropoyetina humano (EpoR) con una constante de velocidad Koff mayor de 1,3 x 10 -3 s -1 y que activa una actividad endógena de dicho EpoR humano en un mamífero, comprendiendo dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera, en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de Fórmula I: Q-V-Q-L-Q-E-S-G-P-G-L-V-K-P-S-E T-L-S-L-T-C-T-V-S-G-A-S-I-S-S-Y Y-W-S-W-I-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-I G-Y-I-X1-X2-X3-G-S-T-N-Y-N-P-S-L-K S-R-V-T-I-S-V-D-T-S-K-N-Q-F-S-L K-L-R-S-V-T-A-A-D-T-A-V-Y-Y-C-A R-E-R-L-G-I-G-D-Y-W-G-Q-G-T-L-V T-V-S-S (SEC ID Nº: 15) en la que: X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en tirosina (Y), glicina (G) y alanina (A); X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en tirosina (Y), glicina (G) y alanina (A), glutamina (E) y ácido aspártico (D); y X3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en serina (S), glicina (G), glutamina (E) y treonina (T) con la condición de que X1 -X2 -X3 sea distinto de Y-Y-S, y la región variable de cadena ligera comprenda una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17. 2. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que dicha constante de velocidad Koff se selecciona del grupo que consiste en 1,4 x 10 -3 s -1 o mayor, 1,9 x 10 -3 s -1 y 4,8 x 10 -3 s -1 . 3. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 4. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 3, donde dicho anticuerpo es un isotipo IgG2. 5. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo humano. 6. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 que se une a EpoR humano con una Kd de 7 nM o mayor. 7. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 6 en el que dicha Kd es de 7 a 32 nM inclusive. 8. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que la región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14. 9. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para activar una actividad endógena de un receptor de eritropoyetina humano para tratar anemia, hipoxemia, hipoxia tisular crónica, insuficiencia cardiaca, enfermedad cardiaca isquémica, insuficiencia renal, daño de células o tejido neural, o para promover la curación de heridas en un mamífero, mediante la administración a dicho mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. 10. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para tratar a un mamífero que padece aplasia, mediante la administración al mamífero que necesita tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. 11. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para tratar a un mamífero que padece anemia, mediante la administración al mamífero que necesita tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. 12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 13. Una secuencia polinucleotídica aislada o purificada que codifica una región variable de cadena pesada y una ES 2 365 924 T3 región variable de cadena ligera, en la que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de Fórmula I: Q-V-Q-L-Q-E-S-G-P-G-L-V-K-P-S-E T-L-S-L-T-C-T-V-S-G-A-S-I-S-S-Y Y-W-S-W-I-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-I G-Y-I-X1-X2-X3-G-S-T-N-Y-N-P-S-L-K S-R-V-T-I-S-V-D-T-S-K-N-Q-F-S-L K-L-R-S-V-T-A-A-D-T-A-V-Y-Y-C-A R-E-R-L-G-I-G-D-Y-W-G-Q-G-T-L-V T-V-S-S (SEC ID Nº: 15) en la que: X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en tirosina (Y), glicina (G) y alanina (A); X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en tirosina (Y), glicina (G) y alanina (A), glutamina (E) y ácido aspártico (D); y X3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en serina (S), glicina (G), glutamina (E) y treonina (T) con la condición de que X1 -X2 -X3 sea distinto de Y-Y-S, y la región variable de cadena ligera comprenda una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17. 14. El polinucleótido de la reivindicación 13, donde dicho polinucleótido codifica una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14. 15. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13. 16. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 15. 17. La célula hospedadora de la reivindicación 16 que es una célula de mamífero. 18. La célula hospedadora de la reivindicación 17 seleccionada del grupo que consiste en una célula CHO, una célula COS y una célula HEK-293. 19. La célula hospedadora de la reivindicación 16 que es una célula de levadura. 20. La célula hospedadora de la reivindicación 16 que es una célula bacteriana. 21. Una secuencia polipeptídica codificada por dicha secuencia polinucleotídica de la reivindicación 13. 36 ES 2 365 924 T3 37 ES 2 365 924 T3 38 ES 2 365 924 T3 39 ES 2 365 924 T3 ES 2 365 924 T3 41 ES 2 365 924 T3 42 ES 2 365 924 T3 43 ES 2 365 924 T3 44 ES 2 365 924 T3 FIGURA 9 A. Ácido nucleico de VH de Ab12 (SEC ID Nº 36) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 6) B. Ácido nucleico de VH de Ab12.6 (SEC ID Nº 37) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 7) ES 2 365 924 T3 FIGURA 9 (Continuación) C. Ácido nucleico de VH de Ab12.56 (SEC ID Nº 38) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 8) D. Ácido nucleico de VH de Ab12.118 (SEC ID Nº 39) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 9) 46 ES 2 365 924 T3 FIGURA 9 (Continuación) E. Ácido nucleico de VH de Ab12.119 (SEC ID Nº 30) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 10) F- Ácido nucleico de VH de Ab12.120 (SEC ID Nº 31) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 11) 47 ES 2 365 924 T3 FIGURA 9 (Continuación) G. Ácido nucleico de VH de Ab12.121 (SEC ID Nº 32) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 12) H. Ácido nucleico de VH de Ab12.122 (SEC ID Nº 33) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 13) 48 ES 2 365 924 T3 FIGURA 9 (Continuación) I. Ácido nucleico de VH de Ab12.123 (SEC ID Nº 34) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 14) 49 ES 2 365 924 T3 FIGURA 10 Ácido nucleico de VL (SEC ID Nº 35) y secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº 17) de Ab de Ab12, Ab12.6 y anticuerpos relacionados con Ab12.6 FIGURA ES 2 365 924 T3 51 ES 2 365 924 T3 52 ES 2 365 924 T3 53 ES 2 365 924 T3 54 ES 2 365 924 T3 ES 2 365 924 T3 56