ANTICUERPOS MONOCLONALES Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPO DE CADENA ÚNICA FRENTE A ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO DE MEMBRANA DE SUPERFICIE CELULAR.

Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que a) se une a antígeno prostático específico de membrana en su forma nativa que está presente en la superficie de células tumorales b) se puede internalizar por una célula tumoral.

c) se une de forma marcada a células LNCAP pero no se une o se une únicamente de forma mínima a células que carecen de la expresión de antígeno prostático específico de membrana y d) se une a un marcador o a un agente citotóxico, caracterizado porque e) el mismo comprende las CDR que tienen SEC ID Nº: 2 a SEC ID Nº: 7 o las CDR que tienen SEC ID Nº: 11 a SEC ID Nº: 16 o las CDR denominadas CDR H1, H2, H3, L1, L2 y L3 como se muestra en la Figura 20 o las regiones de CDR correspondientes como se muestra en la Figura 21

El cáncer de la próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda causa de muerte más común en la civilización occidental. No existe actualmente un tratamiento curativo para este tumor después de la progresión más allá de los límites resecables. Debido a la mortalidad y morbilidad significativa asociada con la progresión de la enfermedad, existe una necesidad urgente de tratamientos dirigidos nuevos. A diferencia del cáncer en otros sistemas orgánicos, el cáncer de próstata representa una diana excelente para terapia de anticuerpo por muchas razones, que incluyen i) la próstata expresa antígenos específicos de tejido, ii) la próstata es un órgano no esencial y su destrucción no dañará al huésped, iii) los sitios de metástasis son ganglios linfáticos y hueso que reciben niveles elevados de anticuerpos circulantes, iv) los niveles en suero de PSA proporcionan un medio para controlar la respuesta terapéutica.

Entre varios marcadores candidatos que se han identificado para el cáncer de próstata, el antígeno prostático específico de membrana (PSMA) parece ser el más importante. Esta glicoproteína de transmembrana de tipo 2 de aproximadamente 100 KD consiste en un segmento intracelular corto (aminoácidos 1-18), un dominio transmembrana (aminoácidos 19-43) y un dominio extracelular extenso (aminoácidos 44-750). PSMA puede servir como una diana útil para inmunoterapia debido a que cumple con los siguientes criterios: i) la expresión está limitada principalmente a la próstata, ii) PSMA se expresa de forma abundante como proteína en todas las fases de la enfermedad, iii) se presenta en la superficie celular pero no se vierte a la circulación, iv) la expresión está asociada con la actividad enzimática o de señalización. PSMA también se expresa en la neovasculatura de la mayoría de otros tumores sólidos y, por lo tanto, puede ser una diana para administración de fármaco anti-angiogenético específico.

Debido a sus especificidades orientadas a diana, se ha puesto un gran énfasis en el desarrollo de anticuerpos monoclonales (mAb) para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas en la medicina del cáncer. Sin embargo, el uso in vivo de mAb está asociado con problemas graves, debido a su tamaño e inmunogenicidad. Por lo tanto, la investigación se ha enfocado en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos más pequeños con menos efectos secundarios, mejor accesibilidad al tumor y velocidades de eliminación más rápidas. La ingeniería genética ha hecho posible construir fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) que son potencialmente herramientas potentes para la terapia del cáncer. Estos anticuerpos pequeños están compuestos de los dominios variables de la cadena ligera (VL) y la cadena pesada (VH) conectados por un péptido de engarce. Los mismos muestran inmunogenicidad pequeña, casi ningún efecto tóxico, una velocidad de eliminación aumentada, una captación mejorada por el tumor y una mejor penetración en las células del tumor. Los scFv murinos recombinantes se pueden establecer de acuerdo con procedimientos convencionales usando bibliotecas de expresión a partir de hibridomas o células del bazo de ratones inmunizados específicamente [Chowdhury y col., Mol. Immunol. 4 (1997), págs. 9-20].

El primer mAb publicado (7E11-C5) frente a PSMA se dirige al dominio intracelular de la proteína y demostró ser altamente específico de la próstata [Horoszewicz y col., Anticancer Res. 7 (1987), págs. 927-935]. También, los anticuerpos monoclonales frente al dominio extracelular de PSMA se han generado después de la inmunización con el antígeno. Sin embargo, aún existe una discrepancia entre la unión del antígeno en células fijas y cortes histológicos por una parte y la unión a células tumorales viables por la otra parte.

El antígeno prostático específico de membrana (PSMA) es un marcador prostático que se expresa altamente en la próstata normal así como en el cáncer prostático. Su expresión está aumentada en el cáncer prostático y se encuentra principalmente y en la próstata.

El antígeno prostático específico de membrana (PSMA) es una proteína celular unida a membrana única que está sobre expresada de forma múltiple en cáncer prostático así como la neovasculatura de muchos tumores sólidos diferentes, pero no en la vasculatura de tejidos normales. Esta expresión única de PSMA lo hace un marcador importante así como una diana extracelular grande de agentes de formación de imágenes. PSMA puede servir como una diana para la administración de agentes terapéuticos tales como citotoxinas o radionúclidos. PSMA tiene dos funciones enzimáticas únicas, folato hidrolasa y NAALADasa y se ha observado que se recicla al igual que otros receptores unidos a membrana a través de depresiones revestidas por clatrina.

Una forma radio-inmuno-conjugada del anticuerpo monoclonal anti-PSMA (mAb) 7E11, está disponible en el mercado como “ProstaScint®” que se usa actualmente para diagnosticar la metástasis de cáncer prostático y la reaparición. El epítopo de PSMA reconocido por el anticuerpo monoclonal 7E11-C5.3 se localiza en el dominio citoplasmático del antígeno prostático específico de membrana.

Sin embargo, también hay informes que describen la expresión de PSMA en tejidos no prostáticos incluyendo riñón, hígado y cerebro. Por lo tanto una explicación posible la proporcionan O'Keefe y col. (Prostate, 2004, February 1; 58

(2) 200-10), concretamente que existe un gen similar a PSMA que posee un identidad del 98% al gen de PSMA en el nivel nucleotídico, que se expresa en riñón e hígado bajo el control de un promotor diferente al gen de PSMA.

El documento WO 01/009192 describe el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos para antígeno prostático específico de membrana. Los anticuerpos monoclonales anti-PSMA humanos se generaron inmunizando ratones con PSMA purificado o preparaciones enriquecidas de antígeno de PSMA. Tal antígeno purificado es un PSMA desnaturalizado ya que el mismo se ha purificado mediante inmunoadsorción después de la lisis celular con detergentes iónicos.

El documento WO 97/35616 describe anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de antígeno prostático específico de membrana. Las inmunizaciones se realizaron con un péptido C-terminal o una preparación de membrana de tumor que expresa PSMA. Los mAb no se unen específicamente a células que expresan PSMA y por lo tanto no se pueden usar con fines de diagnóstico o terapéuticos.

Bander y col., Seminars in Oncology, 2003, págs. 667-677 y el documento US 2004/0213791 describen respectivamente anticuerpos monoclonales dirigidos frente a antígeno prostático específico de membrana. Debido a que la inmunización se realizó con antígeno purificado, los anticuerpos monoclonales no tienen una unión celular elevada y no se pudo obtener scFv de ninguno de estos mAb.

El documento WO 98/03873 describe los mismos anticuerpos que el documento US 2004/0213791 o partes de unión de los mismos que reconocen un dominio extracelular de antígeno prostático específico de membrana. No se pudo demostrar que las partes de unión de los anticuerpos, de hecho, se unen al antígeno. Fracasso y col., The Prostate, 2002, págs. 9-23 describen anticuerpos monoclonales anti-PSMA que están acoplados químicamente a la cadena A de ricina. Las construcciones descritas en este artículo no se unen de forma suficientemente específica a la diana y tienen las desventajas descritas en general de generación de inmunotoxinas.

Es un objeto de la presente invención proporcionar medios y construcciones superiores que ayuden a diferenciar con una mayor fiabilidad entre células tumorales y células sanas que expresan PSMA o una proteína similar y células negativas a PSMA. Tales construcciones se pueden usar para dirigirse más específicamente a cáncer de próstata.

Es otro objeto proporcionar construcciones que destruyan las células de cáncer prostático específicas que expresan PSMA.

El antígeno prostático específico de membrana (PSMA) es una diana atractiva para inmunoterapia de cáncer de próstata. Sin embargo, en células prostáticas el PSMA se expresa con una estructura terciaria y cuaternaria específica y los anticuerpos generados con PSMA desnaturalizado aislado no reconocen eficazmente células tumorales que expresan PSMA. La unión de anticuerpos y scFv a PSMA desnaturalizado se puede obtener después de la inmunización con el antígeno purificado aislado. Sin embargo, la presente... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que

a) se une a antígeno prostático específico de membrana en su forma nativa que está presente en la superficie de células tumorales b) se puede internalizar por una célula tumoral. c) se une de forma marcada a células LNCAP pero no se une o se une únicamente de forma mínima a células que carecen de la expresión de antígeno prostático específico de membrana y d) se une a un marcador o a un agente citotóxico, caracterizado porque e) el mismo comprende las CDR que tienen SEC ID Nº: 2 a SEC ID Nº: 7 o las CDR que tienen SEC ID Nº: 11 a SEC ID Nº: 16 o las CDR denominadas CDR H1, H2, H3, L1, L2 y L3 como se muestra en la Figura 20 o las regiones de CDR correspondientes como se muestra en la Figura 21.

2. Anticuerpo monoclonal aislado o parte de un antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque la intensidad de fluorescencia de PE (IFM) del mAb es mayor que 1000 y la del scFv mayor que 40 a saturación de antígeno.

3. Anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 que muestra una actividad de unión elevada a células LNCAP que alcanza el 50% de la saturación de los sitios de PSMA a concentraciones entre 1 nM y 120 nM.

4. Anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 caracterizado porque el marcador es una partícula que emite radiación radiactiva o de fluorescencia.

5. Anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 caracterizado porque el agente citotóxico es una sustancia tóxica a células seleccionada entre el grupo que consiste en toxinas.

6. Anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque la toxina se selecciona entre el grupo de taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y/o puromicina.

7. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el tratamiento de cáncer.

9. Kit diagnóstico para la detección de células tumorales que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

10. Un procedimiento para la identificación in vitro de células tumorales caracterizado porque las células tumorales que se tienen que identificar se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

11. Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mimo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la identificación de diagnóstico de células tumorales.

12. Uso de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia contigua de al menos 20 nucleótidos de cualquier secuencia del grupo que consiste en SEC ID Nº: 8, 9, 17, 18, 19, 21, 23 y 24 en la preparación de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.