ANTICUERPOS CONTRA NIK, SU PREPARACIÓN Y SU USO.

La presente invención se refiere a moléculas inmunorreguladoras. Más en concreto, la presente invención se refiere a anticuerpos o a fragmentos de anticuerpos capaces de unirse de modo específico a la quinasa inductora de NF-B (NIK)/MAP3K14, o a una porción específica de ésta, y a su uso, por ejemplo para regular una actividad bioquímica de NIK y/o para permitir la detección de NIK o de una porción específica de ésta. Antecedentes de la invención ES 2 365 712 T3 No existe ningún tratamiento ni ningún tratamiento satisfactorio para numerosas enfermedades letales y/o muy debilitantes asociadas con una actividad desregulada de las moléculas de NF-B, incluyendo enfermedades malignas y enfermedades asociadas con respuestas inmunológicas patológicas, tales como enfermedades autoinmunológicas, alérgicas, inflamatorias y relacionadas con transplantes. Las moléculas de la familia del NF-B son complejos de factores de la transcripción eucariotas críticos para la regulación de las respuestas inmunológicas, el crecimiento celular y la supervivencia (Ghosh, S. et al., 1998, Annu. Rev. Immunol., 16:225-260) que son activadas de modo inducible por casi todos los miembros de la familia de receptores de TNF/NGF. Las moléculas de NF-B normalmente están secuestradas en el compartimento citoplásmico mediante la asociación física con un familia de inhibidores citoplásmicos ricos en anquirina denominados IB, que incluye IB y proteínas relacionadas (Baldwin, A.S., Jr., 1996, Annu. Rev. Immunol., 14:649­ 683). En respuesta a diversos estímulos, incluyendo citoquinas, mitógenos y ciertos productos de genes víricos, el IB es fosforilado con rapidez en Ser32 y Ser36, y es ubiquitinado y posteriormente degradado por el proteasoma 26S. Esto permite que el NF-B liberado se transloque al núcleo y participe en la transactivación de genes diana (Mercurio, F. y Manning, A.M., 1999, Curr. Opin. Cell Biol., 11:226-262; Pahl, H.L., 1999, Oncogene, 18:6853-6866). Recientes estudios de clonación molecular han identificado un complejo de quinasa de IB de múltiples subunidades (IKK) que media en la fosforilación inducida por señales de IB, un inhibidor de NF-B. El complejo IKK está compuesto por dos subunidades catalíticas, IKK e IKK, y una subunidad reguladora, IKK (NEMO). La actividad catalítica de IKK e IKK puede ser activada por una multitud de diferentes inductores de NF-B, incluyendo citoquinas inflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleuquina (IL)-1, el receptor de células T (TCR) y la proteína coestimuladora de células T, CD28 (Karin, M. y Ben-Neriah, Y., 2000, Annu. Rev. Immunol., 18:621-663). La quinasa inductora de NF-B (NIK)/MAP3K14 (publicación WIPO nº WO 97/37016A1 de los presentes inventores) es crítica para la activación del NF-B. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión de NIK conduce a una activación fuerte del NF-B (publicado en Wallach, D. et al., 2002, Arthritis Res., 4, supl. 3:S189-196), y se ha demostrado que la expresión de mutantes de NIK catalíticamente inactivos conduce a la inhibición eficaz de la activación del NF-B en respuesta a una diversidad de activadores de NF-B conocidos, tales como LMP1, receptor de TNF (TNFR)-1, TNFR-2, RANK, receptor de Toll humano, CD3/CD28, receptor de IL-1 (IL-1R), proteína Tax del virus linfotrópico de células T humanas (HTLV)-1, y lipopolisacárido (LPS) (Malinin, N.L. et al., 1997, Nature, 385:540-544; Sylla, B.S. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:10106-10111; Damay, B.G. et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:7724-7731; Lin, X. et al., 1999, Immunity, 10:271-280; Geleziunas, R. et al., 1998, Mol. Cell. Biol., 18:5157-5165). La interrupción dirigida del gen NIK (Yin, L. et al., 2001, Science, 291:2165-2165) y el estudio de la raza de ratones con alinfoplasia (aly) que portan una mutación puntual de sentido erróneo Gly885Arg natural en NIK (Shinkura, R. et al., 1999, Nat. Genet., 22:74-77) reveló que la NIK desempeña un papel esencial en el desarrollo de órganos linfoides. Tanto ratones aly/aly como ratones con genes NIK inactivados manifiestan una ausencia sistémica de nodos linfáticos y placas de Peyer, arquitecturas esplénicas y tímicas desorganizadas, e inmunodeficiencia cuyas características más elásticas son unos bajos niveles de inmunoglobulinas séricas y una falta de rechazo a injertos (Shinkura, R. et al., 1999, Nat. Genet., 22:74-77). Estas anomalías parecen reflejar una señalización aberrante por una diversidad de receptores. El desarrollo de deficiencias en los ratones NIK-mutantes se parece a lo que aparece en ratones deficientes en el receptor de LT- (LT-R), lo cual sugiere que NIK también participa en la señalización por este receptor concreto. Se ha podido demostrar que una capacidad proliferativa deteriorada de las células B en ratones aly/aly se correlaciona con una respuesta deficiente de estas células al LPS y al ligando CD40 (CD40L; Garceau, N. et al., 2000, J. Exp. Med., 191:381-386), y la presencia de una cantidad excesiva de células B1 en la cavidad peritoneal de ratones puede atribuirse a defectos en el alojamiento de células peritoneales en el sistema de tejido linfático asociado al intestino (GALT) como consecuencia de una señalización deficiente de los receptores de quimioquinas en el tejido linfoide secundario (Fagarasan, S. et al., 2000, J. Exp. Med., 191:1477-1486). Un papel importante y general para la NIK en la señalización de los receptores de citoquinas se ha demostrado en fecha reciente en estudios realizados por Wallach et al. que han demostrado, utilizando un sistema de dos híbridos, que la cadena del receptor de IL-2, o cadena común, que es un componente señalizador de los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15 e IL-21, se asocia de modo específico con NIK (documento WO 03/087380). Se ha 2 ES 2 365 712 T3 descubierto que la sobreexpresión de la cadena común potencia la activación de NF-B mediada por NIK, y tras la estimulación con IL-2 o IL-15, se ha descubierto que la NIK y los componentes del signalosoma se unen a la cadena común. Por tanto, estos resultados indican la implicación de la NIK en la señalización a través de la amplia variedad de receptores de citoquinas que comprenden la cadena común como subunidad de señalización. Aparte de estas y otras contribuciones a la regulación del desarrollo y la función del sistema inmunológico, la NIK también está implicada en la regulación de diversas funciones no inmunológicas. Los ratones aly/aly (pero no los ratones con genes NIK inactivados) muestran un desarrollo deficiente de las glándulas mamarias (Miyawaki, S. et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:429-434). Además, estudios in vitro han implicado a la NIK en la señalización que conduce a la diferenciación de células del músculo esquelético (Canicio, J. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:20228­ 20233) y a la supervivencia y la diferenciación de neuronas (Foehr, E.D. et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:34021­ 34024). En coherencia con el papel sugerido de la NIK como mediador en la activación de NF-B, los fibroblastos derivados de ratones aly/aly y ratones con genes NIK inactivados no activan el NF-B en respuesta a la activación de LT-R. Además, la sobrerregulación por LT-R de VCAM-1, que se produce a través de la activación de NF-B, es anómala en fibroblastos embriónicos de ratón aly/aly (MEF; Matsumoto, M. et al., 1999, J. Immunol, 163:1584-1591). También se ha advertido una fosforilación deficiente de IB en la respuesta de linfocitos B de aly/aly al acoplamiento de CD40. Por contraste, en células dendríticas de estos ratones, la fosforilación inducida por CD40 de IB es normal (Garceau, N. et al., 2000, J. Exp. Med., 191:381-386). Las células peritoneales de aly/aly también son incapaces de responder a la quimioquina SLC con una mayor actividad NF-B (Fagarasan, S. et al., 2000, J. Exp. Med., 191:1477­ 1486). La evaluación del patrón de especies de NF-B expresadas en órganos linfoides de ratones aly/aly indica que, aparte de su papel en la regulación del complejo o de los complejos de NF-B formados por las proteínas ReI (A+p50) e IB, la NIK también participa en el control de la expresión/activación de otras especies de NF-B. De manera muy notable, los linfocitos de aly/aly son deficientes en p52, una especie de NF-B que se forma específicamente en linfocitos B maduros a través del procesamiento proteolítico de un precursor inactivo, p100 (NF­ B2), lo cual sugiere una deficiencia en la conversión de p100 a p52 (Yamada, T. et al., 2000, J. Immunol., 165:804­ 812). En efecto, se ha demostrado que la NIK participa en la fosforilación específica de sitio de p100. Ambos conducen directamente a la fosforilación de IKK que, a su vez, fosforila a p100. Esta fosforilación actúa como desencadenante molecular para la ubiquitinación y el procesamiento activo de... [Seguir leyendo]

1.- Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de éste que detecta de modo específico la quinasa inductora de NF-kappaB endógenamente fosforilada, NIK, que se caracteriza porque dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión al antígeno es capaz de unirse de modo específico a una porción de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:5 que comprende una treonina fosforilada en la posición del aminoácido 559. 2.- El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado, humano o anti-antiidiotípico. 3.- El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en el que la porción de SEQ ID NO:5 comprende: (a) SEQ ID NO:6; o (b) SEQ ID NO:3. 4.- El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG. 5.- El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fv monocatenario, un Fab, un Fab, un F(ab)2 y una CDR. 6.- El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo también es capaz de regular una actividad bioquímica de una molécula de NIK. 7.- El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 capaz de detectar de modo específico la NIK fosforilada mediante: (a) un análisis de la inmunotransferencia Western; (b) ELISA; o (c) inmunoprecipitación. ES 2 365 712 T3 8.- Un anticuerpo monoclonal generado por el hibridoma NIK-P4 30.12 depositado en el CNCM como nº I-3095, o los fragmentos de este anticuerpo de unión al antígeno. 9.- Un clon de hibridoma depositado en el CNCM como nº I-3095. 10.- Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 11.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para tratar enfermedades autoinmunológicas, alérgicas, inflamatorias, infecciosas y relacionadas con transplantes. 12.- El uso del anticuerpo o de fragmentos de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para tratar enfermedades autoinmunológicas, alérgicas, inflamatorias, infecciosas y relacionadas con transplantes. 13.- La composición farmacéutica de la reivindicación 11 para el tratamiento del asma, la artritis reumatoide, la enfermedad del intestino inflamatoria, la aterosclerosis y la enfermedad de Alzheimer. 14.- El uso de la reivindicación 12, en el que la enfermedad se selecciona del asma, la artritis reumatoide, la enfermedad del intestino inflamatoria, la aterosclerosis y la enfermedad de Alzheimer. 15.- Una composición de materia que comprende un sustrato unido covalentemente a un péptido con la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:3, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una treonina fosforilada en la posición que corresponde a la posición del aminoácido 559 de SEQ ID NO:5, para capturar de modo selectivo el anticuerpo o el fragmento de este anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es capaz de unirse de modo específico al antígeno diana. 16.- La composición de materia de la reivindicación 15, en la que dicho sustrato es una matriz de cromatografía de afinidad. 17.- La composición de materia de la reivindicación 15, en la que dicho sustrato comprende un carbohidrato o un 43 derivado de dicho carbohidrato. ES 2 365 712 T3 18.- La composición de materia de la reivindicación 17, en la que dicho carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en agarosa, Sepharose y celulosa. 19.- La composición de materia de la reivindicación 15, en la que dicho sustrato se selecciona del grupo que consiste en una esfera, una resina o una superficie de plástico. 20.- Un método para preparar el anticuerpo de la reivindicación 8 que comprende cultivar el clon de hibridoma según la reivindicación 9 para permitir que el hibridoma produzca y acumule el anticuerpo según la reivindicación 8. 21.- Un método in vitro para identificar un ligando capaz de inducir la activación de NF-B mediada por NIK en una célula, que comprende introducir el anticuerpo o el fragmento de este anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en una célula, incubar la célula con ligandos individuales, controlar la activación del NF-B, y seleccionar el ligando que ha afectado a la activación de NF-B mediante el bloqueo específico de la actividad NIK por dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo. 22.- El método de la reivindicación 21, en el que la activación de NF-B se determina controlando la degradación de IBalfa. 23.- El método de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que las células son de tipo linfoblastoide. 24.- El método de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que las células se seleccionan de células Ramos, BJAB y Jurkat. 25.- Un método para la purificación de una proteína de unión a NIK, que comprende poner en contacto una muestra que contiene NIK y la proteína de unión a NIK con un anticuerpo o un fragmento de este anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, coinmunoprecipitar la NIK y la proteína de unión a NIK, lavar el complejo inmunológico producido, y recuperar la proteína de unión a NIK del complejo inmunológico utilizando un péptido competidor derivado de NIK. 26.- El método de la reivindicación 25, en el que la muestra se selecciona de fluidos corporales, extractos celulares, y bancos de expresión de ADN. 27.- El uso del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el desarrollo de un ensayo ELISA. 28.- El uso del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la purificación inmunológica de NIK o de su muteína, su derivado funcional, su fracción activa, su derivado circularmente permutado o su sal. 44 ES 2 365 712 T3 Figura 2 ES 2 365 712 T3 46 ES 2 365 712 T3 47 ES 2 365 712 T3 48 ES 2 365 712 T3 49