Un método para alterar el fenotipo oleoso en una planta que comprende:

(a) transformar una planta con una construcción de ADN recombinante que comprende (i) un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de tipo Hap3/Lec1, teniendo el polipéptido al menos el 70% de identidad basándose en el método de Clustal de alineamiento cuando se compara con un polipéptido de (ii) el complemento del fragmento de nucleótidos (i), o (iii) un fragmento de nucleótidos de (i) o (ii) siendo dicho fragmento o una parte del mismo útil en inhibición antisentido o cosupresión en una planta transformada, estando el fragmento de ácido nucleico aislado unido operativamente al menos a una secuencia reguladora; (b) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión de la construcción de ADN recombinante; y (c) seleccionar las plantas transformadas cuyo fenotipo oleoso se ha alterado en comparación con el fenotipo oleoso de una planta no transformada

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud Provisional de Estados Unidos 60/301.913 presentada el 29 de Junio, 2001.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está en el campo del cultivo de plantas y la genética y, en particular se refiere a la alteración del fenotipo oleoso en plantas a través de la expresión controlada de genes selectivos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los lípidos vegetales tienen una diversidad de usos industriales y nutricionales y son centrales para la función de membrana de la planta y su adaptación climática. Estos lípidos representan un vasto conjunto de estructuras químicas y estas estructuras determinan las propiedades fisiológicas e industriales del lípido. Muchas de estas estructuras resultan directa o indirectamente de procesos metabólicos que alteran el grado de insaturación del lípido. Diferentes regímenes metabólicos en diferentes plantas producen estos lípidos alterados y la domesticación de especies vegetales exóticas o modificación de especies adaptadas agronómicamente habitualmente se requiere para producir cantidades económicamente grandes del lípido deseado.

Existen graves limitaciones para el uso de mutagénesis para alterar la composición de ácidos grasos. Las exploraciones raramente descubren mutaciones que a) dan como resultado un fenotipo dominante (“ganancia de función”), b) están en genes que son esenciales para el crecimiento de la planta y c) están en una enzima que no es limitante de la velocidad y que se codifica por más de un gen. En casos en los que los fenotipos deseados están disponibles en líneas de maíz mutantes, su introgresión en líneas de elite por técnicas de cultivo tradicionales es cara y lenta, puesto que las composiciones de aceite deseadas son probablemente el resultado de varios genes recesivos.

Las técnicas de biología molecular y celular recientes ofrecen el potencial para superar algunas de las limitaciones del enfoque de mutagénesis, incluyendo la necesidad de cultivo extensivo. Algunas de las tecnologías particularmente útiles son expresión específica de semilla de genes ajenos en plantas transgénicas [véase Goldberg et al (1989) Cell 56:149-160] y el uso de ARN antisentido para inhibir los genes diana de la planta de una manera dominante y específica de tejido [véase van der Krol et al (1988) Gene 72: 45-50]. Otros avances incluyen la transferencia de genes ajenos en variedades comerciales de elite de cultivos de aceite comerciales, tales como soja [Chee et al (1989) Plant Physiol. 91: 1212=1218; Christou et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7500-7504; Hinchee et al (1988) Bio/Technology 6:915-922; Publicación de EPO 0 301 749 A2], colza [De Block et al (1989) Plant Physiol. 91:694-701] y girasol [Everett et al (198.7) BiolTechnology 5:1201-1204] y el uso de genes como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) en un programa de cultivo, que hace a la introgresión de rasgos recesivos en líneas de elite rápida y menos cara [Tanksley et al (1989) BiolTechnology 7: 257-264]. Sin embargo, la aplicación de cada una de estas tecnologías requiere identificación y aislamiento de genes importantes comerciales.

La regulación de la transcripción de la mayoría de los genes eucariotas se coordina a través de unión específica de secuencia de las proteínas con la región promotora localizada cadena arriba del gen. Muchas de estas secuencias de unión a proteína se han conservado durante la evolución y se encuentran en una amplia diversidad de organismos. Una característica tal es el elemento de secuencia “CCAAT”. (Edwards et al, 1998, Plant Physiol. 117: 1015-1022). Las cajas CCAAT son una característica de los promotores génicos en muchos eucariotas incluyendo varios promotores génicos vegetales.

Las proteínas HAP constituyen una gran familia de factores de transcripción identificados primero en levadura. Estas se combinan para formar un complejo proteico heteromérico que activa la transcripción mediante la unión a cajas CCAAT en promotores eucariotas. Las proteínas HAP ortólogas presentan un alto grado de conservación evolutiva en sus dominios funcionales en todas las especies estudiadas hasta la fecha (Li et al, 1991).

El documento WO 00/28058 publicado el 18 de mayo de 2000 describe polinucleótidos y polipéptidos activadores transcripcionales de la unión a caja CCAAT de tipo Hap3, especialmente, los polinucleótidos y polipéptidos del activador transcripcional 1 de cotiledón de hoja (LEC1).

El documento WO 99/67405 describe los genes de cotiledón de hoja 1 y sus usos.

Los homólogos humanos, murinos y vegetales de proteínas de unión a CCAAT se han aislado y caracterizado basándose en su similitud de secuencia con sus equivalentes de levadura (Li et al, 1991). Este alto grado de homología de secuencia se traduce notablemente en intercambiabilidad funcional entre proteínas ortólogas de diferentes especies (Sinha et al, 1995). A diferencia de la levadura, múltiples formas de cada homólogo de HAP se han identificado en plantas (Edwards et al, 1998).

El análisis molecular y genético reveló que los miembros de HAP están implicados en el control de procesos biológicos diversos y críticos que varían desde desarrollo y regulación del ciclo celular a control metabólico y homeostasis (Lotan et al, 1998; Lopez et al, 1996). En levadura, las HAP están implicadas en el control transcripcional de procesos metabólicos relevantes tales como la regulación de la desrepresión catabólica de cyc1 y otros genes implicados en la respiración (Becker et al., 1991).

En sistemas de mamíferos, varios informes describen HAP como reguladores directos o indirectos de varios genes importantes implicados en la biosíntesis de lípidos tales como sintasa de ácidos grasos (Roder et al, 1997), farnesil difosfato (FPP) sintasa (Jackson et al, 1995; Ericsson et al, 1996), glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPA, Jackson et al, 1997), acetil-CoA carboxilasa (ACC, Lopez et al, 1996) y 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) sintasa (Jackson et al, 1995), entre otras.

Además, también se han indicado que otros factores de transcripción de unión a CCAAT están implicados en diferentes aspectos del control de biosíntesis de lípidos y crecimiento de adipocitos y diferenciación en sistemas de mamíferos (véase McKnight et al, 1989).

Parece que las pruebas actualmente disponibles hasta la fecha apuntan a una familia de proteínas de los factores de restricción de unión a CCAAT como moduladores importantes del metabolismo y biosíntesis de lípidos en sistemas de mamíferos. Dicha determinación no se ha realizado para sistemas vegetales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la materia objeto como se reivindica en este documento.

La memoria descriptiva describe un fragmento de nucleótidos aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un quinto polipéptido que tiene actividad de factor de transcripción de tipo Hap2, teniendo el quinto polipéptido al menos el 70% de identidad basándose en el método de Clustal de alineamiento cuando se compara con un sexto polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, 4, 5, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, ó 208, 210, 212, 214, ó 216;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un séptimo polipéptido que tiene actividad de factor de transcripción de tipo Hap5, teniendo el séptimo polipéptido al menos el 80% de identidad basándose en el método de Clustal de alineamiento cuando se compara con un octavo polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, ó 221;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un decimoséptimo polipéptido que tiene actividad de tipo Hap3/Lec1, teniendo el decimoséptimo polipéptido al menos el 70% de identidad basándose en el método de Clustal de alineamiento cuando se compara con un decimoctavo polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 130, 132, 134, ó 136.

También se describen complementos de dicho fragmento de nucleótidos así como el uso de dichos fragmentos

o una parte de los mismos... [Seguir leyendo]

1. Un método para alterar el fenotipo oleoso en una planta que comprende:

(a) transformar una planta con una construcción de ADN recombinante que comprende

(i) un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de tipo Hap3/Lec1, teniendo el polipéptido al menos el 70% de identidad basándose en el método de Clustal de alineamiento cuando se compara con un polipéptido de SEC ID Nº: 134,

(ii) el complemento del fragmento de nucleótidos (i), o

(iii) un fragmento de nucleótidos de (i) o (ii) siendo dicho fragmento o una parte del mismo útil en inhibición antisentido o cosupresión en una planta transformada,

estando el fragmento de ácido nucleico aislado unido operativamente al menos a una secuencia reguladora;

(b) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión de la construcción de ADN recombinante; y

(c) seleccionar las plantas transformadas cuyo fenotipo oleoso se ha alterado en comparación con el fenotipo oleoso de una planta no transformada.

2. Un método para alterar el fenotipo oleoso en una planta que comprende:

(a) transformar una planta con una construcción de ADN recombinante que comprende un fragmento de nucleótidos aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un factor de transcripción Hap3/Lec1 de planta que tiene al menos el 70% de identidad basándose en el método de Clustal de alineamiento cuando se compara con un polipéptido de SEC ID Nº: 134;

(ii) el complemento de la secuencia de ácido nucleico de (i);

(iii) la secuencia de (i) o (ii) o una parte de la misma que es útil en inhibición antisentido o cosupresión en una planta transformada;

en el que dicha secuencia de ácido nucleico opcionalmente está unida operativamente al menos a una secuencia reguladora;

(b) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión de la construcción de ADN recombinante; y

(c) seleccionar las plantas transformadas cuyo fenotipo oleoso se ha alterado en comparación con el fenotipo oleoso de una planta no transformada.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2 en el que la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, trigo, arroz, colza, Brassica, sorgo, girasol y coco.

4. Un método para mapear variaciones genéticas relacionado con fenotipos oleosos alterados en una planta que comprende:

(a) cruzar dos variedades de planta; y

(b) evaluar variaciones genéticas con respecto a la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 133 en plantas descendientes que resultan del cruce de la etapa (a) realizándose la evaluación usando un método seleccionado del grupo que consiste en: análisis de RFLP, análisis de SNP y análisis basado en PCR.