Un agente de unión que comprende al menos un péptido capaz de unirse a miostatina,

en el que el péptido comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo

Campo de la invención

La invención se refiere a factores de crecimiento y, en particular, al factor de crecimiento miostatina y a agentes que se unen a miostatina e inhiben su actividad.

Antecedentes

La miostatina, también conocida como factor de crecimiento/diferenciación 8 (GDF-8), es un miembro de la familia del factor de crecimiento transformante-B (TGF-) que se sabe que está implicado en la regulación de la masa de músculo esquelético. La mayoría de los miembros de la familia TGF--GDF se expresan de forma no específica en muchos tipos de tejidos y ejercen una diversidad de acciones pleitrópicas. Sin embargo, la miostatina se expresa en gran medida en las células de tejido muscular esquelético en desarrollo y adulto que desempeñan un papel esencial en el control negativo del crecimiento del músculo esquelético (McPherron y col Nature (London) 387, 83-90 (1997)). Sin embargo, ciertos estudios recientes indican que pueden medirse bajos niveles de expresión de miostatina en tejidos cardiaco, adiposo y preadiposo.

La proteína miostatina está muy conservada evolutivamente (McPherron y col PNAS USA 94:12457-12461(1997)). La región C-terminal biológicamente activa de la miostatina tiene una identidad de secuencia del 100 por cien entre las secuencias de ser humano, ratón, rata, vaca, pollo y pavo. La función de la miostatina también parece estar conservada entre especies. Esto es evidente por los fenotipos de animales que tienen una mutación en el gen de la miostatina. Dos razas de vacas, la Belgian Blue ((Hanset R., Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands) pág. 437-449) y la Piedmontese ((Masoero, G. & Poujardieu, B, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production., eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, La Haya, Países Bajos) pág. 450-459) se caracterizan por un fenotipo “double muscling” y aumento de masa muscular. Se demostró que estas razas contenían mutaciones en la región codificante del gen de la miostatina (McPherron y col. (1997) supra). Además, los ratones que contenían una deleción dirigida del gen que codifica la miostatina (Mstn) demuestran un aumento espectacular de masa muscular sin un aumento correspondiente de grasa. Los músculos individuales de los ratones Mstn-/- pesan aproximadamente de un 100 a 200 por ciento más que los de los animales de control y como resultado de una hipertrofia e hiperplasia de las fibras musculares (Zimmers y col. Science 296, 1486 (2002)).

La administración de miostatina a ciertas cepas de ratones, según se ha demostrado, crean una afección similar a los trastornos de desgaste muscular encontrados asociados con cáncer, SIDA y distrofia muscular, por ejemplo. La miostatina administrada como células CHO productoras de miostatina a ratones desnudos atímicos dio como resultado un efecto de desgaste con un alto grado de pérdida de peso, una reducción de hasta un 50% de masa del de músculo esquelético además de desgaste de grasa, e hipoglucemia severa (Zimmers y col. supra).

La pérdida de miostatina parece dar como resultado la retención de masa muscular y una reducción de la acumulación de grasa con el envejecimiento. Se han demostrado que los aumentos relacionados con la edad en la masa de tejido adiposo y la reducción de la masa muscular eran proporcionales a los niveles de miostatina, tal como se determina por una comparación de la masa de grasa y musculo en Mstn+/+ cuando se compara con ratones knockout adultos Mstn-/- (McFerron y col. J. Clin. Invest 109, 595 (2002)). Los ratones Mstn-/- mostraron una reducción de acumulación de grasa con la edad en comparación con los ratones Mstn+/+.

Además, la miostatina puede desempeñar un papel en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre y puede influir en el desarrollo de la diabetes en ciertos casos. Se sabe que, por ejemplo, la resistencia del musculo esquelético a la captación de glucosa estimulada por insulina es la manifestación conocida antes de la diabetes mellitus no dependiente de insulina (tipo 2) (Corregan y col. Endocrinology 128:1682 (1991)). Ahora se ha demostrado que la ausencia de miostatina atenúa parcialmente los fenotipos obesos y de diabetes de dos modelos de ratón, el agoutí amarillo letal (Ay) (Yen y col FASEB J. 8:479 (1994)), y obeso (Lepob/ob). La acumulación de grasa y el peso corporal total del ratón doble mutante Ay/a, Mstn-/- se redujo espectacularmente en comparación con el ratón Ay/a, Mstn+/+ (McFerron y col., (2002) supra). Además, los niveles de glucosa en sangre en los ratones Ay/a, Mstn-/- fue espectacularmente menor que en los ratones Ay/a, Mstn+/+ después de una carga de glucosa exógena, lo que indica que la ausencia de miostatina mejoraba el metabolismo de la glucosa. De forma similar, los ratones Lepob/ob Mstn-/-mostraban una reducción de acumulación de grasa en comparación con el fenotipo Lepob/ob Mstn+/+.

Por lo tanto, existen indicios considerables por los fenotipos de animales knockout y de sobreexpresión de que la miostatina puede desempeñar un papel en la contribución a varios trastornos metabólicos incluyendo trastornos que dan como resultado un desgaste muscular, diabetes, obesidad y hiperglucemia.

La publicación de Patente Internacional WO 02/09641 desvela péptidos capaces de unirse a miostatina que son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la miostatina, incluyendo diabetes de tipo II y obesidad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a agentes de unión que se unen a miostatina e inhiben su actividad. Los agentes de unión comprenden al menos un péptido capaz de unirse a miostatina. Los péptidos de unión a miostatina tienen una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, preferentemente una longitud comprendida entre 10 y 30 aminoácidos, y más preferentemente una longitud comprendida entre 10 y 25 aminoácidos. El péptido de unión a miostatina usado en el contexto de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEC ID Nº: 633).

El péptido de unión a miostatina comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R: b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q: b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, y en el que el péptido de la presente invención tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

En una realización, los agentes de unión de la presente invención comprenden además al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fc, y pueden comprender además al menos una secuencia de ligador. El esta realización, los agentes de unión de la presente invención se construyen de forma que al menos un péptido de unión a miostatina está unido a al menos un vehículo. El péptido o los péptidos se unen directa o indirectamente a través de una secuencia de ligador al vehículo en el extremo N, extremo C o una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En está realización, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada:

(X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma;

en la que F1 es un vehículo, y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de

- (L1)c-P1;

- (L1)c-P1-(L2)d-P2;

- (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;

y - (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e -P3-(L4) -P4;

en los que P1, P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unirse a miostatina; y L1, L2, L3, y L4 son, cada uno, ligadores; y a, b, c, d , e y f son cada uno independientemente 0 ó 1,

a condición de que al menos uno de a y b sea 1 y sales fisiológicamente aceptables de los mismos.

En diversas realizaciones de agentes de unión que tienen esta estructura generalizada, los péptidos P1, P2, P3, y P4 se seleccionan independientemente de uno o más de cualquiera de los péptidos, y cada uno comprende las secuencias de la SEC ID Nº: 353.

En una realización adicional, los agentes de unión comprenden péptidos fusionados a un dominio Fc, directa o indirectamente, proporcionando de esta manera pepticuerpos. Los pepticuerpos de la presente invención presentan una alta afinidad de unión a miostatina y pueden inhibir la actividad de la miostatina tal como se demuestra tanto in vitro usando ensayos basados en células como en animales.

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1. Un agente de unión que comprende al menos un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q;

b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

2. El agente de unión según la reivindicación 1, en el que el péptido se selecciona de uno cualquiera de SEC ID Nº: 305-308, 310-313, 315-331, 333 y 335-346.

3. Un agente de unión, en el que dicho agente tiene la estructura: (X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma; en la que F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de

- (L1)c-P1;

- (L1)c-P1-(L2)d-P2;

- (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;

y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;

en los que P1, P2, P3 y P4 son cada uno péptidos capaces de unirse a miostatina; y cada uno comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, y en los que L1, L2, L3 y L4 son cada uno ligadores; y en los que a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b sea

1, y en los que los péptidos P1, P2, P3 y P4 tienen cada uno una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

4. El agente de unión según la reivindicación 3, en el que los péptidos se seleccionan independientemente de una cualquiera de SEC ID Nº: 305-308, 310-313, 315-331, 333 y 335-346.

5. El agente de unión según la reivindicación 3, en el que a es 0 y b es 1, o en el que a es 1 y b es 0.

6. El agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que el vehículo es un dominio Fc.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica los agentes de unión según la reivindicación 6.

8. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en la que el polinucleótido se selecciona de una cualquiera de SEC ID Nº: 573 a 614 y 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632.

9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

10. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 9.

11. La célula huésped según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula procariota.

12. La célula huésped según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula eucariota.

13. Un procedimiento para preparar un agente de unión a miostatina que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 10 en condiciones que promueven la expresión de la proteína recombinante, y recuperar la proteína.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para inhibir la actividad de la miostatina en un sujeto que necesita del mismo.

16. La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para aumentar la masa muscular magra y resistencia en un sujeto que necesita del mismo.

17. La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para aumentar la proporción de masa muscular magra a grasa en un sujeto que necesita del mismo.

18. La composición según la reivindicación 17, en la que el sujeto es un animal destinado a alimento.

19. La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno

o una enfermedad del degaste muscular en un sujeto que necesita del mismo.

20. La composición según la reivindicación 19, en la que el trastorno o la enfermedad de desgaste muscular se selecciona de lo siguiente: distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardiaca crónica, cáncer, caquexia, SIDA, insuficiencia renal, uremia, sarcopenia relacionada con la edad, artritis reumatoide y desgaste muscular debido a reposo en cama prolongado, ictus, lesión de la médula espinal, enfermedad, fractura ósea, traumatismo, envejecimiento y exposición a microgravedad.

21. La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno metabólico en un sujeto.

22. La composición según la reivindicación 21, en la que el trastorno metabólico se selecciona de los siguientes trastornos: diabetes tipo 2, diabetes mellitus no insulinodependiente, hiperglucemia, pérdida de masa ósea y obesidad.

23. El agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un procedimiento para detectar o diagnosticar un trastorno relacionado con la miostatina en un sujeto.

24. Un procedimiento para medir miostatina en una muestra ex vivo o in vitro que comprende poner en contacto la muestra con el agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y medir el complejo unido.

25. La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en terapia.