La invención se relaciona con reactivos y métodos para la obtención de adenovirus auxiliares auto-inactivantes que,

permiten el desarrollo de sistemas de generación de adenovirus recombinantes de alta capacidad en células y que reducen al máximo la contaminación de dichos adenovirus de alta capacidad por adenovirus auxiliares

Adenovirus auxiliares auto-inactivantes para la producción de adenovirus recombinantes de alta capacidad.

Campo técnico de la invención

La invención se encuadra en el campo de los vectores adenovirales y, más concretamente, en el campo de los sistemas de producción de vectores adenovirales de tercera generación o gutless mediante el uso de adenovirus auxiliares auto-inactivantes que permiten la generación en células de adenovirus recombinantes con una mínima contaminación de los adenovirus de alta capacidad por adenovirus auxiliares.

Antecedentes de la invención

Los adenovirus de alta capacidad (HC-Ad), conocidos también como adenovirus gutless o adenovirus auxiliar-dependientes, tienen un gran atractivo como vectores para terapia génica porque mantienen la alta eficiencia de transducción y el tropismo de los demás vectores adenovirales tanto en roedores como en primates, pero evitan la inmunogenicidad asociada a la expresión de proteínas virales en las células infectadas. Además estos vectores virales tienen una gran capacidad para insertar un transgén de interés (hasta aproximadamente 36 Kb), muy superior a la de otros vectores virales.

Los vectores adenovirales de alta capacidad están basados en adenovirus a los que se les han "vaciado" todas las secuencias virales codificantes. Estos vectores tienen como requerimientos mínimos las regiones terminales del genoma adenoviral (ITR, inverted terminal repeats) que son necesarios para la replicación viral, y la señal de empaquetamiento (ψ), que también actúa en cis.

Dado que los adenovirus de alta capacidad carecen de todas las regiones virales codificantes, requieren para ser propagados de la presencia de un virus auxiliar (helper) delecionado en la región El, que proporciona las proteínas virales en trans. La propagación se lleva a cabo mediante co-transfección o co-infección en líneas celulares 293, en las que se ha integrado la región El delecionada en el virus auxiliar.

Sin embargo, con este sistema de propagación se generan también partículas virales indeseables que encapsidan genomas de virus auxiliar y contaminan las preparaciones finales de los adenovirus de alta capacidad. La acumulación de virus auxiliar es muy variable, pero en ocasiones puede ser tan intensa que desplaza al propio virus de alta capacidad, siendo este uno de los motivos por los que los métodos actuales de producción no tienen la Habilidad necesaria para su uso clínico. El rendimiento es otro factor limitante, en parte relacionado también con el problema de la aparición de virus auxiliar. Hasta la fecha se han desarrollado y descrito diferentes sistemas para disminuir la eficiencia de empaquetamiento del virus auxiliar. En general, estos sistemas están basados en la incorporación de mutaciones en la señal de empaquetamiento del virus auxiliar, en el aumento del tamaño de su genoma, y más particularmente en una eliminación específica de la señal de empaquetamiento durante el procedimiento de producción viral.

Parks y cols. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:13565-13570) han descrito métodos para la eliminación de la señal de empaquetamiento ψ del virus auxiliar mediante un sistema de recombinación Cre-loxP, en el que la señal ψ de dicho virus está flanqueada por sitios loxP. Si la propagación se lleva a cabo en células 293 que expresan la recombinasa Cre, la recombinasa escinde la señal ψ del virus auxiliar, impidiendo que pueda ser empaquetado, pero de manera que retiene las secuencias codificantes necesarias para el empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad. Alternativamente, US7045347 y Ng et al. (Mol Ther 2001; 3: 809-815) han descrito sistemas de inactivación del virus auxiliar basado en virus auxiliares cuya secuencia de empaquetamiento se encuentra flanqueada por sitios frt de reconocimiento de la recombinasa FLP, de forma que la propagación del virus auxiliar en células 293 que expresan la recombinasa FLP de levaduras resulta en la escisión de la secuencia de empaquetamiento.

Estos sistemas tienen la desventaja de que la reacción catalizada por la recombinasa es bidireccional con lo que la secuencia de empaquetamiento puede volver a reintroducirse en el genoma del virus auxiliar. Para evitar este problema, Groth y cols. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97:5995-6000) han propuesto la utilización de una recombinasa unidireccional, en particular la recombinasa PhiC31, utilizando las secuencias attB/attP de reconocimiento específico para flanquear la señal ψ. Cuando la recombinasa PhiC31 escinde la secuencia flanqueada por los sitios attB/attP, modifica las secuencias de reconocimiento y la convierte en secuencias attR/attL evitando que vuelva a producirse el reconocimiento (con reintroducción de la señal ψ).

Sin embargo, todos los métodos se enfrentan al problema de que la eliminación de las secuencias de empaquetamiento del virus auxiliar requiere de la expresión de una recombinasa a partir de su secuencia codificante localizada en el genoma de la célula hospedadora. Dicho proceso ocurre en un momento del ciclo viral en el que la expresión de proteínas celulares se inhibe parcialmente a causa de los efectos citopáticos asociados a la infección por los adenovirus, por lo que es posible que no se alcancen niveles intracelulares de recombinasa lo suficientemente elevados para eliminar todas las copias de adenovirus auxiliar.

Así, se han propuesto métodos alternativos para impedir la generación de adenovirus auxiliares con capacidad de empaquetarse o, cuando menos, para retrasar la formación de estos con respecto a la formación de los vectores gutless. Así, WO2007125146 describe una variante del método descrito anteriormente en el que los vectores adenovirales auxiliares comprenden una secuencia attB del fago ΦC31 entre la secuencia de empaquetamiento y el ITR más próximo a dicha secuencia de empaquetamiento. La inclusión de dicho sitio attB resulta, aún en ausencia de recombinasa ΦC31, en un retraso en el empaquetamiento de los adenovirus auxiliar con respecto a los adenovirus gutless, lo que provoca una disminución de la cantidad de adenovirus auxiliar contaminantes en la preparación de virus gutless. Sin embargo, este método únicamente resulta en un retraso en la formación de los adenovirus auxiliares pero no impide la formación de adenovirus auxiliar con capacidad de empaquetamiento.

Este problema se ha resuelto mediante el sistema adenoviral descrito en DE10159167. En este sistema, la recombinasa está codificada por el adenovirus gutless y el adenovirus auxiliar contiene sitios diana de reconocimiento para la recombinasa que delimitan una región que comprende la señal de empaquetamiento y cuya eliminación resulta en que el gen adenoviral E1, presente en el adenovirus auxiliar en sentido 3' con respecto a un silenciador de la expresión, queda en proximidad con un promotor AAV p5 de la transcripción. De esta manera, en presencia del adenovirus gutless, la recombinasa elimina la región de empaquetamiento del genoma del adenovirus auxiliar a la vez que permite la expresión del gen El, necesario para el empaquetamiento del adenovirus gutless. Sin embargo, este sistema adenoviral incluye un virus auxiliar que expresa El por lo que es un virus replicativo y, por tanto, más peligroso que un virus auxiliar convencional. Además, el virus gutless expresa la recombinasa, lo que no es deseable en un vector terapéutico con potencial uso clínico.

Otra solución alternativa para evitar la dependencia de la recombinasa procedente de la célula empaquetadora es el uso de una recombinasa codificada por el propio virus auxiliar. Así, US20020072120 describe vectores adenovirales auxiliares que codifican una proteína de fusión formada por la recombinasa Cre y el dominio de unión a ligando del receptor de estrógenos, estando dicha proteína de fusión codificada por una secuencia que se encuentra bajo el control operativo de un promotor constitutivo. La proteína de fusión Cre-ER solo se transloca al núcleo y ejerce su actividad recombinasa en presencia de un estrógeno o análogo, con lo que se elimina la necesidad de usar una célula que exprese la recombinasa a la vez que se evita el efecto tóxico de la recombinasa puesto que se puede regular su actividad mediante la adición de estrógenos al medio de cultivo.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de sistemas de empaquetamiento de vectores adeno virales que eliminen las desventajas de los sistemas conocidos...

1. Un polinucleótido que comprende:

2. Un polinucleótido según la reivindicación 1 en donde la región (b) esencial para el empaquetamiento o la replicación del genoma adenoviral es la señal de empaquetamiento Ψ.

3. Un polinucleótido según las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende, adicionalmente, una secuencia que codifica un activador transcripcional que es capaz de activar de forma específica el promotor que regula la expresión de la recombinasa codificada por la secuencia (a) en presencia de un ligando de dicho activador transcripcional.

4. Un polinucleótido según la reivindicación 3 en donde dicho activador transcripcional es un transactivador dependiente de un análogo de tetraciclina.

5. Un polinucleótido según la reivindicación 4 en donde el activador transcripcional es el transactivador rtTA-M2.

6. Un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la recombinasa es Cre o una proteína de fusión que comprende la secuencia de la recombinasa Cre.

7. Un polinucleótido según la reivindicación 6 en donde la recombinasa comprende, adicionalmente, un dominio de unión a hormonas o una secuencia de localización nuclear activable, preferiblemente, el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógenos.

8. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un vector de expresión según la reivindicación 8 en donde dicho vector es un vector adenoviral.

10. Una partícula adenoviral que comprende la secuencia de un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 7.

11. Un sistema para la replicación y empaquetamiento de un adenovirus auxiliar autoinactivante, que comprende:

12. Un sistema según la reivindicación 11 en donde la célula que forma el componente (b) comprende un represor transcripcional específico para el promotor que regula la expresión de la recombinasa específica de sitio.

13. Un sistema según la reivindicación 12, en donde el represor transcripcional es activo en ausencia de un ligando que es capaz de promover la expresión de la recombinasa específica de sitio.

14. Un método para la obtención de un adenovirus auxiliar autoinactivante que comprende

15. Un método según la reivindicación 14 en donde la célula comprende un represor transcripcional específico para el promotor que regula la expresión de la recombinasa específica de sitio en donde dicho represor es activo en ausencia de un análogo de un ligando capaz de activar el promotor que regula la expresión de la recombinasa específica de sitio.

16. Un método según la reivindicación 15 en donde dicho represor transcripcional es el represor tTS dependiente de doxiciclina.

17. Un adenovirus auxiliar obtenido según el método de la reivindicación 16.

18. Uso de un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 7 o de un vector según las reivindicaciones 8 ó 9 o de una partícula adenoviral según la reivindicación 10 que comprende dicho polinucleótido para la producción y empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad.

19. Un sistema para la producción de un adenovirus recombinante de alta capacidad que comprende

20. Un sistema según la reivindicación 19 en donde la célula eucariota comprende un polinucleótido que expresa la recombinasa específica de sitio que está codificada por el componente (a) del sistema.

21. Un sistema según la reivindicación 20 en donde la región que codifica «a la recombinasa específica de sitio se encuentra bajo control operativo de un promotor inducible.

22. Un método para la generación de adenovirus de alta capacidad que expresa un gen de interés que comprende las etapas de

23. Un método según la reivindicación 22 en donde el polinucleótido definido en (a) y/o la célula comprende, adicionalmente, una secuencia que codifica un transactivador específico del promotor que regula la expresión de la recombinasa específica de sitio.

24. Un método según la reivindicación 23 en donde las etapas (i) y/o (ii) se llevan a cabo en presencia de un ligando que es capaz de unirse y activar el transactivador específico del promotor que regula la expresión de la recombinasa específica de sitio.

25. Un método según la reivindicación 24 en donde dicho transactivador es rtTA-M2 y en donde dicho ligando es doxiciclina.

26. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 en donde la célula comprende una secuencia que codifica una recombinasa específica de sitio en donde dicha recombinasa es la misma que está codificada por el polinucleótido definido en (a).

27. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 en donde la recombinasa específica de sitio es Cre o una proteína de fusión que comprende la secuencia de la recombinasa Cre.

28. Un método según la reivindicación 27 en donde la recombinasa es merCremer.

29. Un método según la reivindicación 28 en donde la etapa (i) y/o (ii) se lleva a cabo en presencia de tamoxifeno.

30. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29 que comprende repetir al menos una vez las etapas (i) a (iv) utilizando en la etapa (i) de cada ciclo el adenovirus recuperado en la etapa (iv) del ciclo anterior y, opcionalmente, añadiendo una nueva dosis de adenovirus auxiliar en las etapas (i) de cada ciclo.