VESICULAS EXTRACELULARES DE AMEBAS NO PATOGENICAS UTILES PARA LA TRANSFERENCIA DE UNA MOLECULA DE INTERES A UNA CELULA EUCARIOTICA.

Método para preparar una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés seleccionada de entre el grupo que consiste de una molécula terapéutica,

un agente de formación de imágenes y un agente diagnóstico, comprendiendo las etapas que consisten de:

a) cultivar una ameba no patogénica en un medio de cultivo que comprende dicha molécula exógena de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la célula ameba no patogénica libere vesículas,

b) recuperar una vesícula liberada por dicha célula, conteniendo la vesícula dicha molécula exógena de interés, con la condición de que dicha vesícula no sea una vesícula de Dictyostelium discoideum que contiene Hoechst 3334

Vesículas extracelulares de amebas no patogénicas útiles para la transferencia de una molécula de interés a una célula eucariótica.

La invención se refiere a vesículas membranales de amebas no patogénicas, en particular de Dictyostelium discoideum (Dd), que contienen una molécula de interés, a un método de preparación de dichas vesículas y a los usos de dichas vesículas como vehículo para transferir la molécula de interés a una célula eucariótica.

Recientemente se ha demostrado que diferentes procesos celulares comunes a los organismos multicelulares dependen del tráfico activo de vesículas dirigidas, y que por lo tanto se encuentran relacionados con la dinámica y composición de la membrana celular. Las vesículas sinápticas del sistema nervioso central, las vesículas denominadas "exosomas" en el sistema inmunológico, así como la gemación vírica a partir de células infectadas, son todos ejemplos de rutas de transmisión de información de una célula a otra. Se ha demostrado que los exosomas se originan a partir de endosomas tardíos o de cuerpos multivesiculares (MVB) (Kobayashi et al., 1998). La fusión de exosomas con las células del sistema inmunológico induce la estimulación de las mismas (Kobayashi et al., 2002). La composición de proteínas de estos exosomas aparentemente es dependiente de la célula, con algunos componentes comunes, tales como Tetraspan CD63 y CD82, que desempeñan un papel importante en el transporte de los exosomas.

Los inventores han demostrado anteriormente que las células de Dictyostelium discoideum (Dd), un microorganismo eucariótico, cultivadas en presencia del pigmento de ADN específico de (A-T) Hoechst 33342 (HO342) expulsan eficientemente material fluorescente hacia el medio de cultivo de las mismas. En efecto, las células Dd vivas, que son altamente resistentes a los xenobióticos, no muestran núcleos vitalmente teñidos, mientras que estas células Dd fijadas en metanol al 70% muestran núcleos aparentemente altamente fluorescentes, debido a la permeabilización de la membrana nuclear y a la tinción adicional de los núcleos por el HO342 restante asociado a las células (Tatischeff et al., 1998). La microscopía electrónica y el análisis de lípidos ha demostrado la naturaleza vesicular del material fluorescente externalizado y la presencia de HO342 asociado a dichas vesículas se ha confirmado mediante espectroscopía de fluorescencia. También se ha demostrado que las células Dd vivas liberan vesículas hacia el medio externo de las mismas, tanto durante su crecimiento como bajo condiciones de ayuno (Tatischeff et al., 1998; Tatischeff et al., 2001).

Los inventores han postulado que las vesículas Dd externalizadas podrían participar en la comunicación intercelular entre células Dd. Para mejorar la comprensión de la función de las vesículas Dd, se prepararon vesículas a partir del medio de crecimiento de células Dd cultivadas en presencia de HO342, o a partir de medio de ayuno de las mismas células sometidas a ayuno durante 22 horas en tampón sin HO342. HO342, una molécula hidrofóbica bis-benzimidazol cargada positivamente que es una tinción de ADN específica de (A-T), muestra características de fluorescencia que dependen de su ambiente y del estado de asociación. Estas características se han utilizado para realizar el seguimiento del estado de HO342 en el interior de las vesículas Dd. Los inventores han demostrado la capacidad de las vesículas que contienen pigmento de mediar en la transferencia del pigmento fluorescente a núcleos de células Dd vivas no expuestas, y más importante, dirigen eficientemente el pigmento a los núcleos de las células humanas, tanto sensibles como resistentes a múltiples fármacos. Resulta interesante que la eficiencia de transferencia de HO342 a las células por parte de las vesículas Dd se encontró que era mejor que la transferencia mediada por liposomas que contienen el pigmento. Estos resultados identifican a las vesículas Dd como mediadores de la comunicación intercelular.

Debido a que se ha demostrado que otras amebas liberan vesículas extracelulares, estos resultados indican adicionalmente que las vesículas de ameba no patogénica resultan útiles como nuevas vesículas para el transporte de una molécula de interés, en particular una molécula terapéutica, a células eucarióticas, tales como células de mamífero. Además, estas vesículas presentan una membrana plasmática cuya composición es similar a la de las células de mamífero y carece de factores de virulencia. Esta falta de carácter patogénico permite un uso seguro de las vesículas, evitando simultáneamente efectos secundarios, tales como el choque séptico que podría producirse con vesículas originadas en otros microorganismos, tales como bacterias. De esta manera, las vesículas según la invención podrían encontrar aplicaciones en la vacunación, la terapia génica o cualquier otro tratamiento terapéutico o profiláctico en el que pueda resultar necesaria la transferencia de una molécula de interés a una célula eucariótica.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "ameba no patogénica" se refiere a un protozoo que pertenece a la clase ameba, que no resulta patogénica para una célula eucariótica viva o para un organismo vivo. Entre los ejemplos de ameba no patogénica se incluyen, por ejemplo, Dictyostelium amoebae, tal como Dictyostelium discoideum, o amebas del género Acanthamoeba, tal como Acanthamoeba royreba, o del género Entamoeba, tal como Entamoeba histolytica. Preferentemente, la ameba no patogénica según la invención es Dictyostelium discoideum.

"Dictyostelium discoideum", también denominado "D. discoideum" o "Dd", es un protozoo no patogénico del suelo que crece en forma de células independientes separadas. Tras la exposición a condiciones adversas, por ejemplo el ayuno, la ameba D. discoideum interacciona mediante quimiotaxis, mediante la liberación y transporte de AMPc, formando estructuras multicelulares y agregándose para formar una masa circundada por una matriz extracelular. Las células de D. discoideum comprenden o muestras muchos rasgos característicos de las células eucarióticas superiores, por ejemplo la citoquinesis, la motilidad, la fagocitosis, la quimiotaxis, la transducción de señales, así como procesos de biología del desarrollo, tal como separación celular, formación de patrones y determinación de tipo celular. Bajo condiciones de crecimiento, la ameba permanece en una célula no diferencia y se multiplica mediante mitosis. Tras el ayuno severo, las células de D. discoideum se agregan en masas multicelulares y se diferencian en dos tipos celulares principales.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "vesículas de ameba no patogénica" se refiere a vesículas extracelulares que son liberadas por células de ameba no patogénica. En particular, la expresión "vesículas de D. discoideum" se refiere a vesículas redondas extracelulares, según se observa mediante microscopía electrónica, que son liberadas por células Dd vivas hacia el medio externo de las mismas durante el crecimiento o el ayuno. El tamaño de dichas vesículas es generalmente inferior a 500 nm; preferentemente está comprendido entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm, todavía preferentemente de entre 100 y 300 nm. Dichas vesículas están compuestas de una bicapa lipídica que contiene una fracción citosólica. La bicapa lipídica de las vesículas de D. discoideum contiene habitualmente fosfolípidos (fosfatidilcolina (PC), ácido fosfatídico (PA), fosfoatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), difosfatidilglicerol (DPG)), esfingomielina (Sph), así como el lisofosfolípido ácido liso-bisfosfatídico (LBPA).

La expresión "molécula de interés" se refiere a cualquier molécula, tal como una molécula terapéutica, o una molécula de marcaje, para la que puede desearse la transferencia a una célula eucariótica. Además, dicha molécula de interés puede ser un agente de formación de imágenes útil en el diagnóstico médico, tal como un agente de contraste de formación de imágenes de resonancia magnética, un agente de formación de imágenes de ultrasonidos, o un agente formación de imágenes nuclear. Preferentemente, la molécula de interés es exógena a la ameba no patogénica. El término "exógeno" tal como se utiliza en la...

1. Método para preparar una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés seleccionada de entre el grupo que consiste de una molécula terapéutica, un agente de formación de imágenes y un agente diagnóstico, comprendiendo las etapas que consisten de:

a) cultivar una ameba no patogénica en un medio de cultivo que comprende dicha molécula exógena de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la célula ameba no patogénica libere vesículas,

b) recuperar una vesícula liberada por dicha célula, conteniendo la vesícula dicha molécula exógena de interés,

con la condición de que dicha vesícula no sea una vesícula de Dictyostelium discoideum que contiene Hoechst 33342.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha molécula exógena de interés es una molécula terapéutica seleccionada de entre el grupo que consiste de un antibiótico, un agente antimicrobiano, un agente antimicobacteriano, antifúngico o antivírico, un agente que afecte a la respuesta inmunológica, un regulador del calcio sanguíneo, un agente útil en la regulación de la glucosa, un anticoagulante, un antitrombótico, un agente antihiperlipidémico, un fármaco cardíaco, un fármaco tiromimético o antitiroideo, un adrenérgico, un agente antihipertensivo, un colinérgico, un anticolinérgico, un antiespasmódico, un agente antiulcerativo, un relajante muscular esquelético y liso, una prostaglandina, un inhibidor general de la respuesta alérgica, un antihistamínico, un anestésico local, un analgésico, un antagonista narcótico, un antitusivo, un gente sedante-hipnótico, un anticonvulsivo, un antipsicótico, un agente anti-ansiedad, un agente antidepresivo, un anorexigénico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente antiinflamatorio esteroideo, un antioxidante, un agente vasoactivo, un agente osteoactivo, un agente antiartrítico y un agente antineoplásico.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

5. Vesícula aislada de ameba no patogénica, que contiene una molécula exógena de interés seleccionada de entre el grupo que consiste de una molécula terapéutica, un agente formador de imágenes y un agente diagnóstico, con la condición de que dicha vesícula no es una vesícula de Dictyostelium discoideum que contiene Hoechst 33342.

6. Vesícula según la reivindicación 5, en la que dicha ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

7. Vesícula según la reivindicación 5 ó 6, en la que dicha molécula exógena de interés es una molécula terapéutica seleccionada de entre el grupo que consiste de un antibiótico, un agente antimicrobiano, un agente antimicobacteriano, antifúngico o antivírico, un agente que afecta a la respuesta inmunológica, un regulador del calcio sanguíneo, un agente útil en la regulación de la glucosa, un anticoagulante, un antitrombótico, un agente antihiperlipidémico, un fármaco cardiaco, un fármaco tiromimético o antitiroideo, un adrenérgico, un agente antihipertensivo, un colinérgico, un anticolinérgico, un antiespasmódico, un agente antiulcerativo, un relajante muscular esquelético y liso, una prostaglandina, un inhibidor general de la respuesta alérgica, un antihistamínico, un anestésico local, un analgésico, un antagonista narcótico, un antitusivo, un agente sedante-hipnótico, un anticonvulsivo, un antipsicótico, un agente antiansiedad, un agente antidepresivo, un anorexigénico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente antiinflamatorio esteroideo, un antioxidante, un agente vasoactivo, un agente osteoactivo, un agente antiartrítico y un agente antineoplásico.

8. Vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

9. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés, como vehículo útiles para la transferencia in vitro y/o ex vivo de dicha molécula exógena de interés a una célula de mamífero.

10. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés, para la preparación de un vehículo útil para la transferencia in vivo de dicha molécula exógena de interés a una célula de mamífero.

11. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en la que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

12. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha célula de mamífero es una célula humana.

13. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que dicha célula de mamífero es resistente a múltiples fármacos.

14. Método para la transferencia in vitro y/o ex vivo de una molécula de interés a una célula de mamífero, comprendiendo dicho método la etapa que consiste de poner en contacto una célula de mamífero con una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la vesícula se fusione con la célula de mamífero, de manera que dicha molécula exógena de interés se transfiere a la célula de mamífero.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en el que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que dicha célula de mamífero es una célula humana.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que dicha célula de mamífero es resistente a múltiples fármacos.

19. Composición farmacéutica que comprende una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula terapéutica conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que dicha molécula terapéutica es un agente antineoplásico.